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肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，死亡率位居第二，其特点是恶性程度高，病情进展快，术后易复发和转移。传统的手术、放疗和化疗等的治疗效果均不理想，因此，探索高效低毒的抗肿瘤新药是医药卫生工作者的首要任务。2005年，Robert等将内皮抑素分为8个肽段（hP1～hP8），分别研究其抗肿瘤活性，实验结果显示，内皮抑素的hP1肽段（即内皮抑素的1～27位氨基酸构成的肽段）抗肿瘤活性接近于内皮抑素，其他肽段无活性[1]。2007年黑龙江省生物医药工程重点实验室刘兴汉教授利用定点诱变技术对内皮抑素氨基端的1～31位氨基酸对应的核苷酸序列进行改造，并将25～31位氨基酸序列由RGIRGAD改为RGDRGD，合成了由30个氨基酸构成的30肽[2]（简称30肽）。改造后的30肽包含两个RGD序列，易与肿瘤细胞膜上的整合素结合，进而增强30肽的抗肿瘤活性。本研究选择人肝癌细胞HepG2为研究对象，探讨内皮抑素30肽对HepG2细胞增殖活性和黏附能力的影响，为肝癌的生物治疗提供试验依据和临床应用的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

酵母提取物、胰蛋白胨、IPTG、EDTA、葡聚糖凝胶G15、Matrigel （E1270）（Sigma 公司）；RPMI1640 细胞培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青）；胰酶（Invitrogen 公司）；WST-1试剂盒（Roche公司）；几丁质层析树脂（NEB公司）；人肝癌细胞株HepG2（本室保存）。

1.2 实验方法

1.2.1 30肽的表达及纯化参考Wang等[3]的纯化方法，从构建的pTYB2-T30基因工程表达菌中提取30肽，经几丁质亲和层析纯化后，通过Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定其纯度。

1.2.2 30肽对HepG2细胞生长和活力的抑制实验常规方法培养HepG2细胞，用0.25%的胰酶消化处于对数生长期的细胞，计数活细胞后，在96孔板中接种相同数量的HepG2细胞（每板留1个孔用作空白对照孔）。37℃，5%CO2培养箱中孵育过夜，向各孔中分别加入 30 肽（浓度分别为 0、20、40、60、80、100 μg/ml，每个浓度设5个复孔），37℃孵箱中分别处理24、48 h，弃培养基，PBS冲洗，每孔加入100 μl无血清培养基和10 μl WST-1，37℃孵育 1 h。选择 450 nm 为测定波长，630 nm为参考波长，用酶标仪在570 nm处测定各孔吸光度值。

1.2.3 30肽对HepG2细胞异型黏附能力的影响本实验将Matrigel铺于96孔细胞培养板中，然后加入不同浓度30肽处理的HepG2细胞，MTT法检测30肽对HepG2细胞细胞异型黏附能力的影响。

实验参考Wickstrom等[4-5]的方法。设立对照组和30肽组。在96孔培养板每孔中分别铺上2 μg Matrigel 4℃过夜，加入 2%BSA 20 μl/孔，置于 22℃ 1 h，PBS 冲洗。 HepG2 细胞用 0、20、40、60、80、100 μg/ml的30肽分别预孵育24、48 h，调整细胞密度为5×105个/ml，100 μl/孔加入细胞悬液，置于 37℃细胞培养箱中孵育90 min。用PBS冲洗掉未黏附的细胞，加入MTT 20 μl/孔，孵育 4 h 后弃去 MTT，加入 100 μl/孔DMSO。用酶标仪在570 nm测定吸光度值，计算各组的相对黏附率，每组设3个平行对照，重复3次。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 19.0分析数据，计量资料以

±s表示，组间比较采用方差分析，采用线性回归分析计算30肽的半数抑制浓度（IC50），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 30肽的表达及纯化

重组的内皮抑素30肽经几丁质层析树脂亲和层析后，葡聚糖凝胶G15去除DTT干扰，分别取5、2 μg进行Tricine-SDS-PAGE小肽电泳，结果见图1，在分子量3 kDa左右出现特异条带。

图1 Tricine-SDS-PAGE检测分析纯化30肽电泳

2.2 30肽对HepG2细胞增殖活性的抑制作用

在96孔板中接种相同数量的HepG2细胞，向各孔中分别加入浓度分别为 0、20、40、60、80、100 μg/ml的30肽，37℃孵箱中分别处理24、48 h后，HepG2细胞的增殖活性均被抑制，呈时间剂量依赖性。应用线性回归分析计算 30肽的 IC50为49.7 μg/ml（图2）。

图2 30肽对HepG2细胞增殖活性的抑制作用

2.3 30肽对HepG2细胞黏附能力的抑制作用

在HepG2细胞培养液中分别加入不同浓度的30肽（0、20、40、60、80、100 μg/ml），培养 24 、48 h，显示 30肽能显著抑制HepG2细胞对基质胶Matrigel的黏附（P＜0.05），呈时间剂量依赖性（图 3）。

图3 30肽对HepG2细胞黏附能力的影响

30 肽24 h 及30肽48 h 分别与对照组（剂量=0 μg/ml）比较，*P＜0.05；30肽48 h和30肽24 h比较，#P＜0.05

3 讨论

肿瘤的生长、浸润和转移离不开新生血管的形成，内皮抑素位于胶原蛋白ⅩⅧC末端的第一非胶原结构区域[6-7]。近年来发现其具有抑制肿瘤生长、改善肺纤维化的作用，且与其他多种疾病相关[8-10]。因此，内皮抑素日益得到研究者的关注和重视。

内皮抑素通过抑制肿瘤组织新生血管的生成，断绝肿瘤细胞的血液供应，使细胞处于休眠状态，间接地抑制肿瘤的生长，已作为一种抗肿瘤药物用于临床。但在临床治疗中，内皮抑素存在单独注射所需剂量大，内皮抑素蛋白不稳定，停药后易复发等不足，对其结构进行改造以减少其毒副作用是临床应用的发展趋势。人工构建的30肽不仅包括内皮抑素的1～27位氨基酸活性区，还含有2个重复的由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成的RGD序列[11-12]。RGD序列主要存在于细胞外基质（ECM）蛋白中，通过与多种整合素特异性结合[13-14]，促进细胞对生物材料的黏附，抑制肿瘤血管生成，进而影响肿瘤细胞的增殖、分化、转移及凋亡等多种活动[15-16]。本研究采用WST-1试剂盒检测细胞存活和生长活性，实验中选择了人肝癌HepG2细胞为实验材料，在96孔板中接种相同数量的HepG2细胞，向各孔中分别加入浓度分别为 0、20、40、60、80、100 μg/ml的30肽，37℃ 5%CO2孵箱中分别处理24、48 h后，HepG2细胞的增殖均被抑制，呈时间剂量依赖性。

肿瘤的侵袭转移是一个连续、渐进的多因素、多步骤的动态过程，涉及原发肿瘤细胞的生存发展，肿瘤细胞增殖能力和生存能力的增强，肿瘤细胞黏附性的改变，肿瘤细胞的局部浸润并随着血液循环转移等过程[17-18]。肿瘤细胞的黏附性改变在肿瘤细胞的浸润和转移中极为重要。细胞黏附可分为细胞与细胞间黏附及细胞与ECM黏附。细胞与细胞间黏附异常时，肿瘤细胞易从原发灶脱落并黏附到ECM和基底膜，这是肿瘤细胞侵袭转移过程的第一步[19]。ECM的主要成分是纤维粘连蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）和Ⅳ型胶原蛋白，本研究在体外黏附实验中采用Matrigel（主要成分是FN、LN和Ⅳ型胶原蛋白）作为黏附基质，模拟体内黏附过程。实验显示，HepG2细胞对人工基底膜胶Matrigel具有较强的黏附能力，加入30肽后，从40 μg/ml开始，肿瘤细胞对Matrigel的黏附能力明显降低，并呈时间剂量依赖性，提示30肽可通过抑制肿瘤细胞对基质成分的黏附作用来降低肿瘤细胞的转移能力，为临床上生物活性肽用于肿瘤治疗提供了理论和实验依据[20-22]。

终上所述，内皮抑素30肽能有效抑制HepG2细胞的增殖和黏附，在临床上有望成为肝癌的辅助治疗手段之一，30肽对肝癌HepG2细胞侵袭与转移能力的影响及机制是今后本课题的主要研究目标。

[参考文献]

[1]Tjin Tham Sjin RM，Satchi-Fainaro R，Birsner AE，et al.A 27-amino-acid synthetic peptide corresponding to the NH2 terminal zinc-binding domain of endostatin is responsible for its antitumor activity[J].Cancer Res，2005，65（9）：3656-3663.

[2]Li D，Liu X，Zhao W，et al.Gene cloning，expression and activity of anti-tumor peptide of human endostatin[J].J Med Mol Biol，2007，4（6）：475-479.

[3]Wang SJ，Liu XH，Ji YB，et al.Study on biological activity of two modified anti-tumor peptide of tumstatin[J].Prog Biochem Biophys，2007，34（11）：1152-1161.

[4]Wickstrom SA，Alitalo K，Keski-Oja J.An endostatin-derived peptide interacts with integrins and regulates actin cytoskeleton and migration of endothelial Cells[J].J Biol Chem，2004，279（9）：20 178-20 185.

[5]Chen BQ，Yang YM，Gao YH，et al.Inhibitory effects of c9，t11-conjugated linoleic acid on invasion of human gastric carcinoma cell line SGC-7901[J].World J Gastroenterol，2003，9（9）：1909-1914.

[6]Poluzzi C，Iozzo RV，Schaefer L.Endostatin and endorepellin：A common route of action for similar angiostatic cancer avengers[J].Adv Drug Deliv Rev，2016，97：156-173.

[7]O'Reilly MS，Boehm T，Shing Y，et al.Endostatin：An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J].Cell，1997，88（2）：277-285.

[8]曲波，秦晓风.重组人血管内皮抑素联合卡培他滨及奥沙利铂治疗胃肠癌合并恶性腹腔积液的疗效[J].中国肿瘤临床与康复，2018，25（4）：443-445.

[9]Wan YY，Tian GY，Guo HS，et al.Endostatin，an angiogenesis inhibitor，ameliorates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J].Respir Res，2013，14（1）：56-68.

[10]韩敏，王坚，王久胜.重组人内皮抑素结合化疗对晚期非小细胞肺癌患者血清LMTK-3和IGFBP-7的影响[J].中国现代医学杂志，2018，28（9）：55-59.

[11]Thysiadis S，Katsamakas S，Dalezis P，et al.Novel c（RGDyK）-based conjugates of POPAM and 5-fluorouracil for integrin-targeted cancer therapy[J].Future Med Chem，2017，9（18）：2181-2196.

[12]Bartolomé RA，Peláez-García A，Gomez I，et al.An RGD motif present in cadherin 17 induces integrin activation and tumor growth[J].J Biol Chem，2014，289（50）：34 801-34 814.

[13]Boudjadi S，Carrier JC，Groulx JF，et al.Integrin α1β1expression is controlled by c-MYC in colorectal cancer cells[J].Oncogene，2016，35（13）：1671-1678.

[14]Nieberler M，Reuning U，Reichart F，et al.Exploring the role of RGD-recognizing integrins in cancer[J].Cancers，2017，9（9）：116-149.

[15]Xie F，Ding RL，He WF，et al.In vivo antitumor effect ofendostatin-loaded chitosan nanoparticles combined with paclitaxel on Lewis lung carcinoma[J].Drug Deliv，2017，24（1）：1410-1418.

[16]Wang X，Zhan RY，Wang YY，et al.Endostatin improves cancer-associated systemic syndrome in a lung cancer model[J].Oncol Lett，2015，9（5）：2023-2030.

[17]王峥嵘，庞静欢，周艳，等.FXR mRNA表达量与肝恶性肿瘤复发转移关系探讨[J].中国现代医生，2017，55（7）：1-4.

[18]李永庆，尚培中，柳勇，等.VEGF和SLeX表达与甲状腺乳头状癌浸润转移的关系[J].中国医学创新，2016，13（21）：5-8.

[19]Erreni M，Siddiqui I，Marelli G，et al.The Fractalkine-receptor axis improves human colorectal cancer prognosis by limiting tumor metastatic dissemination[J].J Immunol，2016，196（2）：902-914.

[20]吴迅.重组人血管内皮抑素时间窗研究进展[J].西部医学，2017，29（12）：1777-1780.

[21]Rosca EV，Koskimaki JE，Rivera CG，et al.Anti-angiogenic peptides for cancer therapeutics[J].Curr Pharm Biotechnol，2011，12（8）：1101-1116.

[22]Hamley IW.Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics[J].Chem Rev，2017，117（24）：14 015-14 041.