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近年来，由于广谱抗生素和免疫抑制药物的使用、器官移植及有创导管技术的开展，侵袭性念珠菌病（invasive candidiasis，IC）的发病率不断上升，正越来越受到临床重视[1]。我们的前期研究显示，免疫功能低下参与IC的发生、发展，提高免疫功能可以改善IC小鼠的预后[2]。作为临床治疗脾虚证的经典方剂之一，补中益气汤具有补中益气、升阳举陷的功效[3]。已有基础研究证实，补中益气汤可提高脾气虚动物模型的免疫功能[4]。本研究拟探讨补中益气汤联合抗真菌药物治疗IC动物模型的有效性和可能机制，为补中益气汤应用于IC的临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型的建立

选取60只雄性昆明小鼠[许可证编号：SCXK（粤）2009-0011]，体重20～25 g，由中山大学实验动物中心提供。

实验开始前2 d给予环磷酰胺200 mg/kg预处理，实验开始前1 d给予环磷酰胺100 mg/kg预处理，实验开始后第4天给予环磷酰胺200 mg/kg复制免疫缺陷小鼠模型。将白念珠菌（沙保弱培养基37℃培养 48 h）配制标准混悬液（1×109 cfu/ml），采用腹腔注射白念珠菌混悬液的方法，制作IC小鼠模型[5-6]。

1.2 主要试剂

中药复方为黄芪30 g，升麻6 g，柴胡6 g，边条参10 g，炙甘草 15 g，当归 6 g，橘皮 6 g，白术 10 g。所有药材均购自广州市药材市场，经鉴定为合格品。生药加适量水浸泡30 min，煎煮2次（分别为1.5 h和1 h），将滤液混合并浓缩至补中益气汤1 g/ml，4℃保存备用；环磷酰胺（江苏恒瑞，H32020857）；白念珠菌（由中山大学中山医学院微生物学教研室提供，ATCC90028）；伊曲康唑口服液（比利时杨森，H20130425）；ELISA试剂盒（美国 R&Dsystem 公司，批号：20175244231）；FITC荧光抗体（美国Pharmingen公司，批号：201564587）。

1.3 实验分组及处理

将造模成功的60只雄性昆明小鼠随机分为对照组和实验组，每组30只。对照组和实验组均给予抗真菌药物灌胃治疗（伊曲康唑口服液，50 mg/kg，Q12 h，稀释成1 ml溶液）。实验组同时给予补中益气汤4 g/（kg·d）灌胃，对照组同时给予等量生理盐水灌胃。动物模型建立后第7天处死实验动物，取0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm肾组织匀浆，沙保弱培养基37℃培养48 h，进行肾组织念珠菌菌落计数，以明确是否建模成功。采集肝组织标本储存于-80℃冰箱备用[5-6]。

1.4 观察指标及检测方法

两组IC小鼠第7天生存率；实验动物处死后取肝脏匀浆，取上清液；留取腹主动脉血0.5 ml。采用酶联免疫吸附（ELISA）检测IC小鼠肝组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-10 表达；采用ELISA检测IC小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10的表达；采用流式细胞仪检测IC小鼠淋巴细胞亚群中 CD3+、CD4+、CD8+和 CD4+/CD8+表达。

1.5 统计学方法

数据采用SPSS 21.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，采用 t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组IC小鼠第7天生存率的比较

实验组IC小鼠第7天累计死亡10只，对照组累计死亡18只。实验组的第7天生存率（66.7%）显著高于对照组（40.0%），差异有统计学意义（P=0.038）。

2.2 两组IC小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-10表达的比较

实验组IC小鼠肝组织中的IL-10表达显著低于对照组（P<0.05）；两组 IC 小鼠肝组织中的 TNF-α、IL-6表达比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 两组IC小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-10表达的比较（pg/ml，

±s）

2.3 两组IC小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10表达的比较

实验组IC小鼠血清中的IL-10表达低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组IC小鼠血清中的 TNF-α、IL-6 比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 两组 IC小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-10表达的比较（pg/ml，

±s）

2.4 两组淋巴细胞亚群的比较

实验组的CD4+/CD8+比值显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组的 CD3+、CD4+、CD8+比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3 两组淋巴细胞亚群的比较（

±s）

3 讨论

3.1 IC的发病机制

IC是临床常见病、多发病，与有创操作、广谱抗感染药物的使用、慢性基础疾病直接相关，常导致预后不良和治疗费用增加[7]。念珠菌属，尤其是最常见的白念珠菌，在生理状态下定植在消化道，一旦出现创伤、应激等病理生理学改变，就会通过多种渠道播散感染，即发生侵袭性改变。目前临床使用的抗真菌药物以三唑类、棘白菌素类和多烯类为主，其作用靶点是破坏真菌细胞壁或细胞膜及其组分。随着卡泊芬净、伏立康唑等新型抗真菌药物投入临床，IC摆脱了既往治疗药物缺乏的尴尬境地，但IC治疗效果仍不容乐观，探索IC新的治疗靶点已成为当前研究的热点。

西医和中医对于IC的发病机制有相似的见解。通过大量临床研究，鉴于念珠菌是机会致病菌的事实，目前西医认为，免疫功能紊乱在IC的发生、发展过程中发挥重要作用[8-9]。T辅助淋巴细胞在组织相容性复合体Ⅱ（MHCⅡ）的限制下，分化为Thl和Th2两类。 Thl细胞可分泌 IL-2、干扰素（IFN）、TNF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等，通过炎症级联反应，促进吞噬、杀灭真菌；同时使细胞变性、坏死、血管通透性增加，导致组织和器官损伤。Th2细胞可分泌IL-4、IL-10等，通过刺激B淋巴细胞产生抗体，对真菌感染起调理素样作用，同时抑制Thl细胞功能，使感染迁延[10-11]。淋巴细胞参与IC发病机制的表现在CD4+/CD8+比值的变化，已得到基础和临床研究的证实[2]。

中医认为，IC的病机特点为本虚标实，邪盛正衰[10]。卫气发挥正气防御外邪的作用，是肺、脾、肾功能协调旺盛的结果，即卫气化生于肾中之阳气，充养于中焦脾胃，散布于肺气的宣发，而三脏协调旺盛的关键又在于脾[12-13]。

中医学认为，中医脾与淋巴的免疫功能密切相关[12-14]。《脾胃论》指出“内伤脾胃，百病由生”。脾不仅主运化水谷精微，为后天之本，还能行使防御功能。IC多因年老、久病、长期卧床、外伤等原因致肺脾亏虚，痰湿、痰热等外邪乘虚而入，肺失宣降、脾失健运所致[10-15]。补中益气汤为宋代李杲《内外伤辨惑论》之方剂，具有补中益气、升阳举陷之功，是临床上治疗脾虚证的经典方剂。研究表明，补中益气汤可提高脾气虚动物模型中的免疫器官指数，有助于提高免疫功能[12-16]。目前针对补中益气汤治疗脾虚动物模型的研究仅限于T淋巴细胞增殖能力和脾淋巴细胞抗氧化损伤，尚无将补中益气汤用于治疗IC动物模型的相关研究[11-17]。

3.2 免疫调理治疗与IC的综合救治

基于抑制过度炎症反应和提升细胞免疫的免疫调理一度是脓毒症治疗的希望，但存在以下几点问题：脓毒症范畴涵盖内外科疾病及其他基础疾病，疾病一致性较差，不利于小样本研究评价；免疫调理治疗重在宏观治疗，即外周血炎症指标和细胞免疫指标变化趋势，但免疫调理治疗的靶器官以及细胞和亚细胞结构功能是否发生改变尚难以有效评估。我们的前期研究结果显示，补中益气汤可以通过抑制氮化应激水平促进念珠菌病动物模型肝细胞线粒体的生物发生，降低氮化应激程度与肝细胞保护的相关作用，提示补中益气汤可能促进IC动物模型的肝功能修复[13-18]。因此本研究通过以下设计，阐述观点：补中益气汤是否可以降低IC动物模型的死亡率；补中益气汤是否可以减轻靶器官炎症和全身炎症反应综合征；补中益气汤是否可以改善IC动物模型中细胞的免疫功能。本研究结果显示，实验组IC大鼠第7天的生存率显著高于对照组（P<0.05），实验组IC大鼠肝组织和血清中的IL-10表达均显著低于对照组（P<0.05），实验组淋巴细胞亚群中CD4+/CD8+比值显著高于对照组（P<0.05），提示补中益气汤可以提高IC小鼠第7天生存率，可能与提高细胞免疫功能和降低免疫抑制的发生有关。

免疫调理治疗阐释了IC的重要发病机制，是IC治疗的重要研究方向。本研究提示，补中益气汤在IC治疗中有一定的应用前景，其量效关系仍需进一步研究。

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