灯盏花乙素制备工艺的实验教学设计
太志刚 戴伟锋 林连兵
昆明理工大学生命科学与技术学院,云南昆明 650500
[摘要]《制药工艺学》是制药工程专业的重要课程,开展课程实验设计对于提升《制药工艺学》教学效果较为重要。基于云南丰富的灯盏花资源,昆明理工大学生命科学与技术学院开展了《制药工艺学》教学实验-灯盏花乙素的制备工艺。本实验教学通过热回流提取、萃取、聚酰胺酚柱层析和结晶几个步骤,即可从云南特色植物-灯盏花中获得纯度较高的灯盏花乙素。实验易于操作,实验内容涵盖了原材料预处理、提取、分离纯化及干燥等课程内容。通过以上实验教学,有效地提高《制药工艺学》的教学质量。
[关键词]制药工艺学;灯盏花乙素;制备工艺;教学设计
[中图分类号]R544.1
[文献标识码]A
[文章编号]1674-4721(2018)8(c)-0169-04
[基金项目]云南省高等学校创新创业教育改革试点学院项目({2016}72号-2);昆明理工大学2017年课程考核改革项目({2017}100 号-32)
[作者简介]太志刚(1975-),男,云南昆明人,博士,副教授,研究方向:天然药物化学
▲通讯作者:林连兵(1969-),男,教授,副院长,研究方向:生物制药方向
The design of instructional experiment of preparation method of scutellarin
TAI Zhi-gang DAI Wei-feng LIN Lian-bing
School of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Yunnan Province,Kunming 650500,China
[Abstract]Pharmaceutical technology is the important specialized curriculum of the pharmaceutics engineering.It is more important to carry out experimental design of the course to improve the teaching efficiency of pharmaceutical technology.The resources of Erigeron breviscapus is abundant in Yunnan,Kunming University of Science and Technology,School of Life Science and Technology conducted the teaching experiments of the preparation method of scutellarin from Erigeron breviscapus.Highly purified scutellarin can be obtained from the characteristic plant-Erigeron breviscapus by reflux extraction,extraction,polyacrylamide column chromatography and crystallization.The experiment is easy to operate.The experimental content covers the course content of raw material pretreatment,extraction,separation and purification,and drying.Through the above experimental teaching,the teaching quality of pharmaceutical technology can be effectively improved.
[Key words]Pharmaceutical technology;Scutellarin;Preparation process;Experimental teaching design
《制药工艺学》是制药工程、药物制剂专业的专业核心课程,课程内容主要以阐述原料药及其制剂研发与生产中的制药工艺学问题为主线,分别介绍了化学药物、生物制品、中药和天然药物等原料药制药工艺学的研究内容和方法,以“安全、有效、经济和环保”为制药工艺理念,培养学生解决复杂实际生产问题的能力[1-2]。在传统的《制药工艺学》教学中存在着以下问题:①《制药工艺学》开课前学生接触工程实际问题的机会较少,实践基础薄弱,学生没看见实际制药工艺路线,所以不能深刻理解制药工艺学。②教学主要以课堂讲授为主,学生兴趣不高,教学效果不好。③教材中的实际列子很少,显得陈旧,学生不能及时了解目前最新制药工艺技术。④《制药工艺学》是一门实践性很强的课程,传统的考试模式是以闭卷笔试为主,不能提高学生运用基本原理和技术解决实际问题的能力[3-4]。在当前着力培养解决实际问题、有创新能力的高素质人才的背景下[5],为了能使学生运用课程中的基本原理和技术解决实际问题的能力,笔者在教学安排上增加《制药工艺学》教学实践环节。
1 实验教学的方法
1.1 目的
通过《制药工艺学》教学实验设计,调动学生学习积极性,引导学生应用制药工艺知识解决药物制备的实际问题。培养学生运用知识的能力、综合思考的能力及团队合作能力,为后续的科研和实际工作打下基础。
1.2 实验教学的实施方法
总课时数18个学时,每组6人,实验前请安全老师现场进行实验室安全培训并考核安全操作知识(此部分成绩占30%),之后指导老师现场详细讲解“灯盏花乙素制备工艺”的制备原理及实验过程,并指导实验记录和数据的收集处理的方法及规范书写实验报告的技巧。
实验中期,每个小组推荐一名同学以PPT的形式汇报自己的工作进展,研究并解决实验中出现的问题,补充实验方案并请老师进行审阅,指导老师从“安全”、“环保”和“经济有效”方面考虑,形成具有的实验方案,完成相关记录。
实验结束后,每个小组推荐一名同学做结题报告,报告内容包括“灯盏花乙素制备工艺”的背景、方案、步骤、结果和结论,重点突出本组制备工艺的创新点。指导老师和其他同学提出问题学生答辩,最终指导老师从PPT汇报质量、工艺路线经济有效、工艺路线科学和创新性给出成绩(此部分成绩占50%)。最后按照《昆明理工大学学报.自然科学版》格式让学生书写“灯盏花乙素制备工艺”研究论文,指导老师根据论文的逻辑性、科学性和可读性给出成绩(此部分成绩占20%)。综合以上教学环节给出学生成绩。通过以上实验教学,对比几组学生做出的结果,本研究提出较为安全、经济、有效和环保的“灯盏花乙素制备工艺”路线。
2 实验的具体过程
2.1 实验设计对象的选择
昆明理工大学生命科学与技术学院制药工程中心在《制药工艺学》教学实验设计时,以云南特色药用植物资源为出发点,选择原料易得到和有药效的植物开展《制药工艺学》教学实验。
灯盏花为菊科飞蓬属植物短葶飞蓬,灯盏花主要分布在云南,约占全国资源量的 98%[6],资源极易得到,具有良好的疗效,民间用于头痛、风湿痛、脑血管意外引起的瘫痪等[7]。灯盏花乙素是灯盏花中的主要有效成分,具有抗凋亡[8]、抗纤维化用[9]、神经保护,减轻神经细胞损伤[10]和抗凝及改善循环的药理作用[11-12]。目前,临床应用灯盏花乙素有较多剂型,包括片剂、颗粒剂、注射剂、注射粉针剂等[13-15]。综合以上,灯盏花原材料在云南资源丰富、易得、具有良好药效,可以作为《制药工艺学》实验教学实践的良好素材。
2.2 实验仪器和试剂
2.2.1 仪器 回流提取罐 (20 L小型多功能提取罐,上海雅程仪器设备有限公司),旋转蒸发器(R-1050Ex防爆旋转蒸发仪,郑州长城科工贸有限公司),硅藻土过滤机(WK220,广东恒东科技有限公司),真空干燥箱(YZF-6020T台式真空干燥箱,上海姚氏仪器设备厂),核磁共振仪(Bruker AV-600,布鲁克(北京)科技有限公司)。
2.2.2 试剂 乙醇、氯仿、正丁醇、甲醇和丙酮均为工业级,购自于昆明有机化工原料有限公司;聚酰胺酚树脂购自于无锡市阿尔兹化工有限公司;NaOH和盐酸为分析纯,购自于国药集团化学试剂有限公司;薄层层析板购自于青岛海洋有限公司。
2.3 实验设计的方案
通过文献调研和实验条件的摸索,对比了几条实验路线,结合制药工艺学教材内容和云南红河灯盏花生物技术有限公司的实际生产工艺,最终确定以下实验方案。
2.3.1 灯盏花乙素的提取 取2.0 kg阴干的灯盏花,粉碎至4~5 mm,回流提取罐中提取,加入10 kg乙醇溶液(75%,V/V),60℃下回流提取 3次,浓缩得粗提物(195.5 g),于 1.0 kg的热水中(50 ℃)搅拌超声辅助分散均匀,冷却,先后用等体积的氯仿和正丁醇萃取3次,氯仿萃取部分备用,将正丁醇萃取部分浓缩至固液比为1:2,冷却,硅藻土过滤后得到A液。
2.3.2 灯盏花乙素的分离 将聚酰胺酚材料与A液按1 L︰120 g比例混合,混合物置于旋转蒸发器中减压回收正丁醇后置于玻璃柱中,分别用体积比为7:1、5:1、3:1、2:1、1:1和0:1的氯仿甲醇二元溶剂梯度洗脱,合并2:1和3:1洗脱部分,加适量水,将氯仿从中萃取并回收,剩余物置于旋转蒸发仪中浓缩至无醇味,升温至 60℃,搅拌逐滴加入 NaOH(2 mol/L)溶液,调pH7.0,热过滤,将滤液浓缩至固液比为1:5,在30 r/min的搅拌速率下,降温至15℃(速率为10℃/h)静置24 h,过滤,水洗至无色,可得灯盏花乙素钠盐。以上操作所得物均与灯盏花乙素对照品进行薄层分析,粗判灯盏花乙素的存在和含量,证实工艺操作有效性。
2.3.3 灯盏花乙素钠盐的还原 将灯盏花乙素钠盐置于65%的丙酮水溶液中,加热至60℃,30 r/min搅拌使之完全溶解,逐滴加入盐酸(6 mol/L)溶液,调pH为 5.0,将灯盏花乙素钠盐还原为灯盏花乙素,降温至15℃(速率为 10℃/h)静置 12 h,过滤,少量水洗涤,将产物于40℃真空干燥8 h,可得含量大于90%的灯盏花乙素。
2.3.4 灯盏花乙素的结构鉴定 所得化合物与灯盏花乙素对照品进行薄层分析,初步鉴定为灯盏花乙素,通过核磁共振测定,所得数据如下。ESI-MS(m/z):463[M+H]+,1H NMR (500MHz,D VERTICAL-ALIGN: sub">6)δ:7.94(2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6),6.98 (1H,s,H-8),6.93 (2H,d,J=8.5Hz,H-3,5),6.81 (1H,s,H-3),5.20 (1H,d,J=7.5 Hz,H-1);13CNMR(125 MHz,D VERTICAL-ALIGN: sub">6)δ:163.5(C-2),102.4(C-3),182.1(C-4),149.8(C-5),147.1(C-6),161.4 (C-7),94.1 (C-8),153.2 (C-9),104.6 (C-10),121.8 (C-1,),128.5 (C-2),116.6 (C-3,),129.9(C-4,),116.0(C-5,),129.6(C-6),100.1(C-1),71.2(C-2),75.3(C-3),74.8(C-4),72.2(C-5),207.1(C-6)。与文献[16]进行数据对比,鉴定该化合物为灯盏花乙素。
3 实验教学中的注意事项
3.1 灯盏花采收和灯盏花乙素成分的预判
采收灯盏花全草后,取10 g样品粗提后进行预实验,通过与灯盏花乙素对照品进行定量薄层分析,预判灯盏花全草中是否含有灯盏花乙素,根据展开斑点的大小初步判定灯盏花乙素的含量。
3.2 灯盏花乙素制备工艺
在灯盏花乙素制备工艺制备过程中,从安全、经济、有效和环保的角度出发设计灯盏花乙素制备工艺路线的可行性和合理性,具体分析如下。
3.2.1 安全环保 在实验之前请安全老师现场进行实验室安全培训并考核安全操作知识,重点围绕实验所用到的危险化学物质的安全措施、规范化操作(包括加压、减压、加料、加热、冷却、过滤、旋蒸和干燥),操作中使用可回收的有机溶剂包括乙醇、乙酸乙酯和氯仿等,做到零排放。
3.2.2 经济有效 ①本实验采用热提取罐,将60℃的乙醇溶液连续加到灯盏花全草上部,由上至下通过灯盏花堆积层,进而溶解和提取灯盏花全草中的有效成分,在这一自上而下的过程中,灯盏花中的有效成分含量与提取溶剂中有效成分含量保持高梯度,灯盏花全草中的有效成分快速溶出,提取效率增加。②提取后采用50℃热水分散粗提物,采用氯仿和正丁醇萃取,氯仿和水可去除小分子、叶绿素、糖、大分子蛋白质等杂质,之后的硅藻土过滤操作可除去正丁醇萃取部分的大颗粒胶质和悬浮物等杂质,以上操作可显著减少杂质,便于后续操作,提高灯盏花乙素的产率。③因硅胶吸附量较大,导致灯盏花乙素产率降低,本实验不采用硅胶柱层析法纯化。聚酰胺酚选择性吸附黄酮类物质[17],易于购买,死吸附少,可重复利用。本实验采用干法装填聚酰胺酚柱,将灯盏花提取物中的黄酮类物质(包括灯盏花乙素)充分吸附在聚酰胺酚上,灯盏花乙素大多易被氯仿-甲醇(2:1)洗脱,少量被氯仿-甲醇3:1洗脱,将2:1和3:1洗脱部分合并,灯盏花乙素成分得以富集,同时也减少了损失率。④经聚酰胺酚柱分离操作后,灯盏花乙素得以富集,加适量水,灯盏花乙素转溶到乙醇水液中,同时萃取回收氯仿。⑤灯盏花乙素结构中糖单元6位是羧基,与碱成盐后水溶性增强,用酸还原可得灯盏花乙素,溶解性改变[18-19]。根据这一特性,反复调节pH,不断改变溶解度并结晶,通过以上操作就能得到纯度大于90%的灯盏花乙素。
4 实验教学心得
本实验涵盖了《制药工艺学》教学内容的中药制药工艺和药物纯化工艺,通过以上实验,使学生加深了以上教学内容的思考和理解,掌握了中药制药的基本工艺流程和药物后处理工艺流程,引导学生学会从安全、有效、经济和环保的角度出发思考制药工艺路线的合理性和可行性,培养学生解决复杂实际生产问题的能力。同时,在实验过程中还碰到了一些具体问题,如提取率降低、杂质多等,通过对以上问题的分析和解决,加深了对制药工艺的认识和理解。
综上所述,通过灯盏花乙素的制备工艺实验教学,有效提高了学生《制药工艺学》的积极性,加深了学生对本课程的思考和认识,提高了教学质量。
[参考文献]
[1]赵临襄,赵广荣.制药工艺学[M].北京:人民卫生出版社,2014.
[2]刘雪梅,黄宇琪,廖国建,等.基于案例研究的制药工艺学实践教学改革与思考[J].中华医学教育探索杂志,2016,15(3):248-251.
[3]郭莹,余勤,李天一,等.基于“以学生为中心”和综合能力培养的制药工艺学兴趣课堂的构建[J].浙江中医药大学学报,2016,40(4):317-319.
[4]李传润,彭成军,李家明,等.基于创新和学生能力培养的制药工艺学综合性实验改革——以苯妥英钠合成工艺优化为例[J].安徽中医药大学学报,2017,36(2):89-91.
[5]张旦旦,李会,史劲松,等.设计性实验开设原则及规范化教学过程探索[J].生物学杂志,2017,34(6):120-122.
[6]杨生超,张雪峰,李黎,等.灯盏花种质资源灯盏乙素和咖啡酸酯含量[J].中国中药杂志,2009,34(2):239-240.
[7]苏梅,杨和金,崔涛,等.栽培灯盏花提取物的药效学研究[J].中成药,2011,33(6):938-943.
[8]景艳芸,李陈广,颜亮,等.灯盏花乙素对J774A.1巨噬细胞中ATP诱导的炎症小体活化和细胞焦亡的影响[J].中国药理学通报,2018,34(2):174-180.
[9]闫瑢玓,方慧,迟莉.灯盏花乙素对肝星状细胞及TGF-β1/Smad 信号通路的作用评价[J].环球中医药,2016,9(11):1314-1317.
[10]李红娥,吴春云.脑缺血损伤中灯盏乙素脑保护作用的研究进展[J].神经解剖学杂志,2017,33(1):95-97.
[11]华宝桐,赵玲,蔡红雁,等.HCMEC细胞在灯盏花乙素及低能量震波联合作用下血管生成相关因子的研究[J].辽宁中医杂志,2016,5(10):2155-2157.
[12]陈晨,李清清,张秀娟,等.灯盏花乙素对自发性高血压大鼠血管舒缩反应的影响[J].中国当代医药,2018,25(2):4-6.
[13]邓宇斌,王竟男.负载灯盏花乙素的壳聚糖衍生物的生物学性能及对糖尿病视网膜病变的疗效研究[J].中国病理生理杂志,2015,2(10):1871.
[14]谭建玲,邢翔飞,陈进兵,等.外翻肠囊法研究灯盏花素小肠吸收的影响因素[J].中国药房,2015,26(13):1763-1766.
[15]张利华,宋健,陈蔚蔚,等.灯盏花素口腔速溶膜剂的制备及质量考察[J].中国当代医药,2016,23(23):4-7.
[16]Cui JM,Fang G,Duan YB,et al.Total synthesis of scutellarin-7-O-Glucuronide[J].J.Asian Nat Prod Res,2005,7(4):655-660.
[17]李梓盟,张柯达,吴金虎.聚酰胺树脂纯化复方“前愈”总黄酮的工艺研究[J].中国新药杂志,2016,25(8):913-916.
[18]伏继平,林艳和,杜江.一种灯盏花乙素钠盐结晶I及其制备方法:CN105399788 A[P].2016.
[19]段银,樊献俄,樊献乔,等.一种灯盏花乙素晶型及其制备方法:CN 106967139 A[P].2017.
(收稿日期:2018-04-16 本文编辑:闫 佩)