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甲状腺乳头状癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，其发病率近年来不断升高，其中大部分是微小乳头状癌[1-3]。甲状腺微小乳头状癌是指肿瘤长径≤1 cm的甲状腺乳头状癌，预后通常较好，但是也有部分病例具有高侵袭性[4-6]。因其体积较小，常伴发结节性甲状腺肿，极易被漏诊或误诊。细针穿刺活检是目前术前诊断甲状腺乳头状癌最有效准确的方法[7-9]，但由于细针穿刺所获标本量有限，不能反映病变全貌，约20%的结节仍难以准确定性[10-11]。因此，寻找能够帮助诊断甲状腺微小乳头状癌的分子标志物十分必要。有研究表明，甲状腺乳头状癌组织标本的Midkine（中期生长因子）表达水平明显高于甲状腺良性病变[12-13]。本研究在甲状腺微小乳头状癌的细针穿刺细胞学标本中，应用免疫细胞化学方法进行Midkine检测，探讨其对甲状腺微小乳头状癌鉴别诊断的应用价值及与临床病理因素的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年8月～2017年5月我院收治的50例甲状腺微小乳头状癌患者、30例结节性甲状腺肿患者的术中细针穿刺标本作为研究对象。患者术后均经病理组织学检查确诊。甲状腺微小乳头状癌组患者中，男 14 例，女 36 例；年龄 22～67 岁，平均（48±7）岁。结节性甲状腺肿组患者中，男9例，女21例；年龄25～59岁，平均（46±8）岁。甲状腺微小乳头状癌、结节性甲状腺肿患者的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会审核批准，所有患者均知晓本研究情况并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集用22 G针头接10 ml一次性注射器，在甲状腺结节中多点、反复负压抽吸3～5次，将抽出物直接均匀涂于3～8张多聚赖氨酸处理过的玻片上。玻片置于95%酒精中固定15 min，然后放入保湿密闭的切片盒中，置于-20℃冰箱中冷冻保存待用。

1.2.2 免疫细胞化学试剂兔抗人Midkine抗体购自北京北方生物技术研究所有限公司；兔超敏二步法免疫组化检测试剂盒（PV9001）及二氨基联苯胺显色液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；苏木素购自江苏凯基生物技术有限公司。

1.2.3 免疫细胞化学实验方法于冰箱中取出细胞涂片，置室温10～15 min复温。经蒸馏水洗涤后，在柠檬酸盐缓冲液pH6.0中抗原热修复20 min。3%过氧化氢室温孵育10～20 min，阻断内源性过氧化物酶，PBS缓冲液冲洗3 min×3次。滴加牛血清白蛋白封闭，室温孵育20 min。滴加100倍稀释的一抗兔抗人Midkine抗体4℃过夜，PBS缓冲液冲洗3 min×3次。置于37℃水浴锅内复温45 min。滴加反应增强液，37℃孵育20 min，PBS缓冲液冲洗3 min×3次。滴加增强酶标山羊抗兔IgG聚合物，37℃孵育20 min，PBS缓冲液冲洗3 min×3次。二氨基联苯胺显色5 min，双蒸水冲洗。苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片观察。用已知阳性切片作阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3 评价标准

以细胞胞质内有清晰棕黄色颗粒为阳性细胞。阳性细胞占比≥10%的标本判定为阳性，反之，判定为阴性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（

±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲状腺微小乳头状癌、结节性甲状腺肿患者细针穿刺标本Midkine表达阳性率的比较

甲状腺微小乳头状癌细针穿刺标本Midkine的表达阳性率明显高于结节性甲状腺肿，差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。

表1 甲状腺微小乳头状癌、结节性甲状腺肿患者细针穿刺标本Midkine表达阳性率的比较（例）

与结节性甲状腺肿组比较，*P＜0.01

2.2 不同临床病理特征甲状腺微小乳头状癌患者细针穿刺标本Midkine表达阳性率的比较

不同性别、年龄、被膜有/无侵犯甲状腺微小乳头状癌患者的细针穿刺标本Midkine表达阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。无淋巴结转移甲状腺微小乳头状癌患者21例，Midkine阳性表达14例（66.7%）；有淋巴结转移甲状腺微小乳头状癌患者29例，Midkine阳性表达27例（93.1%），有淋巴结转移甲状腺微小乳头状癌患者的细针穿刺标本Midkine表达阳性率高于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 不同临床病理特征甲状腺微小乳头状癌患者细针穿刺标本Midkine表达阳性率的比较[n（%）]

3 讨论

目前术前诊断甲状腺微小乳头状癌最有效准确的方法是细针穿刺活检。由于细针穿刺活检获得的细胞学标本中组织形态与细胞间质结构大部分丧失，病理医师进行诊断时主要依赖于对细胞，主要是其细胞核形态特征性改变的识别，如核膜不规则、核沟、核内假包涵体、毛玻璃样核及砂砾体形成等，但不少甲状腺微小乳头状癌并不具备这些典型特征。许多良性肿瘤病变及非肿瘤病变也可有核沟、毛玻璃样核等改变。特别是甲状腺微小乳头状癌结节小，穿刺获得的标本细胞含量往往少，常常仅含有少量的肿瘤细胞，诊断和鉴别诊断更成困难[14]。为提高甲状腺癌术前诊断的准确性，目前进行了大量关于甲状腺癌分子标志物的研究[15]。

Midkine又称中期生长因子，最初在视磺酸诱导分化的早期胚胎瘤细胞中发现。Midkine在妊娠中期胚胎组织大量表达，分布广泛，之后逐渐减少，成年后只在少数组织中可检测出。Midkine具有多种生物学活性，可以促进细胞生长、有丝分裂及细胞分化，增强纤维溶酶活性，促进神经元生长等[16]。近年已有研究发现，Midkine在多种肿瘤组织中过度表达，不仅能促进肿瘤细胞的生长，具有对抗肿瘤细胞凋亡的作用，影响肿瘤细胞的存活、增殖与分化，还可参与肿瘤的血管生成，直接参与肿瘤的生长、转移过程[17]。Maeda等[18]发现，Midkine在胰头癌组织中的表达阳性率为53.3%，Midkine表达阳性的患者5年生存率低于表达阴性的患者，多变量分析表明Midkine表达是胰头癌预后的独立预测因子。Zhao等[19]报道，Midkine在胃癌组织中呈过表达，而且其表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移相关，Midkine表达阴性的胃癌患者5年生存率高于表达阳性的患者。Jham等[20]研究表明，Midkine在口腔鳞状细胞癌中的表达增加，并和肿瘤分期密切相关，在晚期口腔鳞状细胞癌中表达更高。

本研究通过免疫细胞化学方法检测甲状腺微小乳头状癌、结节性甲状腺肿患者细针穿刺标本中Midkine的表达，结果提示，甲状腺微小乳头状癌细针穿刺标本Midkine的表达阳性率明显高于结节性甲状腺肿，差异有统计学意义（P<0.01），提示细针穿刺标本Midkine的检测可为甲状腺微小乳头状癌的正确诊断提供参考。接着按照多种临床病理参数进行分层分析，研究结果提示，有淋巴结转移甲状腺微小乳头状癌患者的细针穿刺标本Midkine表达阳性率高于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P<0.05），提示甲状腺微小乳头状癌细针穿刺标本中Midkine的表达与颈部淋巴结转移相关，细针穿刺标本Midkine的检测可为甲状腺微小乳头状癌淋巴结转移的预测进而为治疗决策的制定提供帮助。但本研究样本较少，有必要进行更大样本的研究。

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