中药牛大力对尿酸盐诱导小鼠模型滑膜细胞炎症的影响
黄 慧 陈 洪▲ 黄桂琼 袁维蔚
广东省惠州市中医医院药剂科，广东惠州 516001
[摘要]目的 探讨中药牛大力对尿酸盐诱导小鼠模型滑膜细胞炎症的影响。方法 SPF级雄性Wistar小鼠60只随机分成正常对照组、模型组和研究组[牛大力低（4.55 g/kg）、中（9.10 g/kg）、高（13.65 g/kg）剂量组]，每组各 10 只。除正常对照组外连续给药7 d，正常对照组及模型组不做任何给药，每日灌胃等量的生理盐水，其余四组均通过小鼠右侧踝关节注射尿酸盐制造急性痛风性关节炎模型，检测比较造模前和注射尿酸盐48 h的血清一氧化氮（NO）、白细胞介素 1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、前列腺素 E2（PGE2）等炎症因子水平和血清尿酸（UA）水平。模型组验膜成功后脱颈处死并取关节囊和滑膜组织行HE染色观察小鼠右侧踝关节滑膜组织病理改变情况，牛大力各剂量组以牛大力低、中、高剂量煎制成汤药，每天上午9点灌胃治疗1次，均连续治疗7 d。治疗3、7 d时再次检测比较牛大力低、中、高剂量组的血清炎症因子水平和血清UA水平，并在治疗7 d后两组滑膜组织行HE染色观察小鼠右侧踝关节滑膜组织病理改变情况。结果 四组注射尿酸盐48 h的血清NO水平较建模前降低，而血清IL-1β、TNF-α、PGE2等炎症因子水平和血清UA水平均高于建模前，差异有统计学意义（P＜0.05）。HE染色观察显示，牛大力中、高两剂量组滑膜组织血管充血肿胀，炎性细胞浸润明显。牛大力低、中、高剂量组治疗3、7 d的血清NO水平均明显高于模型组，而血清炎症因子水平和血清UA水平均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；牛大力低、中、高剂量组治疗3、7 d的血清NO水平均明显高于治疗前，而血清炎症因子水平和血清UA水平均低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗7 d后HE染色观察显示，牛大力低、中、高剂量滑膜组织炎症浸润改善，病症缓解，但模型组小鼠滑膜组织炎症无明显改善。结论 中药牛大力有助于缓解尿酸盐诱导小鼠模型滑膜细胞炎症，值得推广。
[关键词]牛大力；尿酸盐；小鼠；滑膜细胞；炎症
[中图分类号]R332
[文献标识码]A
[文章编号]1674-4721（2018）7（b）-0008-04
[基金项目]广东省中医药局科研项目（20173016）
▲通讯作者
Influence of Chinese herbal medicine Millettia speciosa champ on the synovial cells inflammation of mouse model induced by urate
HUANG HuiCHEN Hong▲ HUANG Gui-qiongYUAN Wei-wei
Department of Pharmacy,Traditional Chinese Medicine Hospital of Huizhou City,Guangdong Province,Huizhou 516001,China
[Abstract]Objective To investigate the influence of Chinese herbal medicine Millettia speciosa champ on the synovial cells inflammation of mouse model induced by urate.Methods A total of 60 male Wistar mice of grade SPF were randomly divided into the normal control group,the model group,and the study group(low doses group of 4.55 g/kg,middle does group of 9.10 g/kg,and high doses group of 13.65 g/kg),10 cases in each group.Except for the normal control group,the drug was continuously given to 7 d,while the normal control group and the model group did not take any medicine,and given the same amount of normal saline daily to the stomach,the other four groups were injected urate into the right ankle joint to create an acute gouty arthritis model.The levels of serum nitric oxide(NO),interleukin-1β(IL-1β),tumor necrosis factor(TNF-α),prostaglandin E2(PGE2),and serum uric acid(UA)were measured and compared between before model establishment and after injection of urate 48 h.After successful examination,the model group was sacrificed and the joint capsule and synovial tissue were selected.HE staining was used to observe the pathological changes of the synovial tissue of the right ankle joint in mice.Each dose group was decocted with low,medium and high doses of Millettia speciosa champ,each group was treated with gavage for 1 times at 9 am,for 7 consecutive days.In the treatment of 3 and 7 d,the levels of serum inflammatory factors and serum UA levels in the low,medium and high doses groups of Millettia speciosa champ were measured again,and after 7 d treatment,the synovial tissues of two groups were stained with HE to observe the pathological changes of synovial tissue in the right ankle.Results The level of serum NO in four groups after injection of urate 48 h was lower than that before modeling,while the serum levels of IL-1β,TNF-α,PGE2and serum UA were higher than those before the modeling,with significant difference (P＜0.05).HE staining showed that there was congestion and swelling in the blood vessels of synovial tissue in the medium and high doses groups of Millettia speciosa champ,and the infiltration of inflammatory cells was obvious.The serum NO levels in the low,medium and high dose groups of Millettia speciosa champ in the treatment of 3 and 7 d were significantly higher than those in the model group,and the level of serum inflammatory factors and serum UA in the low,medium and high dose groups of Millettia speciosa champ in the treatment of 3 and 7 d were lower than that in the model group,with significant difference (P＜0.05).The serum NO levels in the low,medium and high dose groups of Millettia speciosa champ in the treatment of 3 and 7 d were significantly higher than those before treatment,and the level of serum inflammatory factors and serum UA in the low,medium and high dose groups of Millettia speciosa champ in the treatment of 3 and 7 d were lower than that before treatment,with significant difference (P＜0.05).After treatment for 7 d,HE staining showed that the inflammatory infiltration of the synovial tissue in the low,middle and high doses group of Millettia speciosa champ was improved and the disease was relieved,but there was no obvious improvement in the synovial tissue inflammation in the model group.Conclusion Chinese herbal medicine Millettia speciosa champ can help alleviate the inflammation of the mouse model synoviocytes induced by urate,which is worthy of popularizing.
[Key words]Millettia speciosa champ;Urate;Mice;Synovial cells;Inflammation
痛风性关节炎是由嘌呤代谢障碍和血尿酸（UA）增高所引发的组织损伤，临床发病率较高[1-2]，因此，对痛风性关节炎进行及时有效的治疗十分重要。然而目前尚无有效的痛风性关节炎治疗药物和方法，对其有效治疗药物的开发具有重要的临床意义[3-4]。近年来，中医药在痛风性关节炎治疗中的应用得到了多个研究的认可，其中牛大力在其中的应用较多[5-7]。本研究亦关注了中药牛大力应用于痛风性关节炎对小鼠滑膜细胞炎症的影响，从而为其在痛风性关节炎中的应用推广提供依据，现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取SPF级雄性Wistar小鼠60只，均为雄性小鼠，由第三军医大学动物中心提供，单独饲养自由进食和饮水。将所有小鼠编号并按随机数字表法分为正常对照组（n=10）、模型组（n=10）、牛大力低剂量组（n=10）、牛大力中剂量组（n=10）、牛大力高剂量组（n=10）。本研究符合医学伦理学标准并经本院医学伦理学委员会审核批准。各组小鼠的基本资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1），具有可比性。
表1 各组小鼠基本资料的比较（±s）

1.2 实验方法
1.2.1 牛大力高、中、低模型组剂量确定 参考徐叔云教授主编的《药理实验方法学》附录；若人的临床剂量为 A mg/kg，则小鼠的剂量＝A mg/kg×70 kg×0.0026/20 g＝A mg/kg×70 kg×0.0026/0.02 kg＝9.1 A mg/kg。
牛大力单方临床使用量为0.5～1.5 g/kg，通过公式换算得到小鼠剂量范围为4.55～13.65 g/kg。即牛大力高剂量组给药量为13.65 g/kg，牛大力中剂量组给药量为9.10 g/kg，牛大力低剂量组给药量为4.55 g/kg。
1.2.2 建模 将除正常对照组外的其余四组小鼠均在右侧踝关节注射100 μl的3%尿酸钠溶液，关节囊对侧鼓起确认注入成功，制造急性痛风性关节炎模型。
1.2.3 实验室指标检测 分别在造模前1 d和注射尿酸盐48 h检测血清一氧化氮（NO）、白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、前列腺素 E2（PGE2）等炎症因子水平和血清UA水平，检测当天在眼眶后静脉丛取血，将获得的样本均常规进行离心和冷藏待测处理，其中血清UA水平和血清NO水平的检测采用全自动生化分析仪，血清 IL-1β、TNF-α、PGE2等炎症因子水平的检测采用酶联免疫吸附法，相关试剂盒均购自上海康朗生物科技有限公司，具体检测操作严格按照说明书要求进行。
1.2.4 组织病理检测 模型组验膜成功后脱颈处死并取关节囊和滑膜组织，将获取的组织固定后常规进行石蜡包埋和切片，并常规行HE染色，光镜下观察小鼠右侧踝关节滑膜组织病理改变情况。
1.2.5 治疗方法 正常组及模型组每天早上9点灌胃15 ml生理盐水。牛大力各剂量组以牛大力低（4.55 g/kg）、中（9.10 g/kg）、高（13.65 g/kg）备用药液每天上午 9 点灌胃治疗1次，每次10 ml，均连续治疗7 d。
1.2.6 治疗后指标检测 治疗3、7 d时再次检测比较牛大力各剂量组血清炎症因子水平和血清UA水平，具体取样和检测方法同“1.2.3”。并在治疗7 d后两组滑膜组织行HE染色观察小鼠右侧踝关节滑膜组织病理改变情况，具体取样和检测方法同“1.2.4”。
1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0统计学软件对数据分析，计数资料比较采用校正χ2检验，计量资料均符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，多组计量资料比较采用方差分析，进一步两两比较采用q检验，两组计量资料比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组治疗前后血清炎症因子水平和血清UA水平的比较
治疗前，各组血清炎症因子水平和血清UA水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。四组注射尿酸盐48 h的血清NO水平明显低于建模前，而血清IL-1β、TNF-α、PGE2等炎症因子水平和血清UA水平均高于建模前，差异有统计学意义（P＜0.05）；牛大力低、中、高剂量组治疗3、7 d的血清NO水平明显高于模型组，而血清炎症因子水平和血清UA水平均明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；牛大力低、中、高剂量组治疗3、7 d的血清NO水平明显高于治疗前，而血清炎症因子水平和血清UA水平明显低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。
2.2 尿酸盐诱导小鼠模型滑膜细胞炎症HE染色观察
HE染色观察显示，模型组滑膜组织血管充血肿胀，炎性细胞浸润明显（图1-B）。

 
图1 各组HE染色切片图
A.正常对照组HE染色；B.模型组HE染色；C.低剂量组炎症无明显改善；D.牛大力中剂量组炎症浸润改善；E.牛大力高剂量组炎症浸润改善
2.3 牛大力低、中、高三剂量组小鼠滑膜组织炎症变化分析
治疗7 d后HE染色观察显示，牛大力中、高剂量组滑膜组织炎症浸润改善，病症缓解，但牛大力低剂量组小鼠滑膜组织炎症无明显改善（图1-C、图1-D、图1-E）。
表2 各组治疗前后血清炎症因子水平和血清UA水平的比较（±s，n=10）

 
与同组建模前比较，#P＜0.05；与同组治疗前比较，*P＜0.05；与模型组同期比较，△P＜0.05
3 讨论
痛风性关节炎为高尿酸所引发的相关关节病症，近年来随着饮食结构的改变，其临床发病率不断升高[8-9]。关节炎症可给患者带来明显的疼痛感甚至影响其正常生活活动，降低患者生活质量[10-13]。本研究通过小鼠右侧踝关节注射尿酸盐制造急性痛风性关节炎模型，所有研究小鼠均验模通过，可进行相关研究。本研究中的急性痛风性关节炎小鼠模型血清学指标检测结果显示血清NO水平降低，而血清IL-1β、TNF-α、PGE2等炎症因子水平以及血清UA水平升高。急性痛风性关节炎小鼠持续高血清UA水平炎症反应和血管内皮损伤严重，HE染色观察结果显示，急性痛风性关节炎小鼠滑膜组织血管充血肿胀，炎性细胞浸润明显，而外观可见其右侧踝关节明显肿大，部分可影响活动。改善痛风性关节炎的炎症反应性对改善其疗效具有重要意义[14]。
近年来，中医药技术在临床中的应用不断推广，其在痛风性关节炎中的应用也得到了认可[15-17]。在抗炎治疗中，牛大力的应用较多，牛大力可提高免疫功能、抗炎抗氧化，在临床中应用较为广泛[18-19]。本研究将牛大力应用于急性痛风性关节炎小鼠模型治疗中，结果显示，中药牛大力治疗有助于血清NO水平升高，而血清炎症因子水平和血清UA水平降低；免疫病理检查显示其可改善急性痛风性关节炎小鼠的滑膜组织炎症浸润，缓解病症，进一步证实了牛大力在痛风性关节炎中的应用效果，其机制可能是本研究治疗药方中的牛大力补虚润肺、强筋活络，辅以千斤拔祛风除湿、舒筋活络、强筋壮骨、消炎止痛功效以及土茯苓的泄浊解毒、健胃利湿、通利关节功效可有效抑制急性痛风性关节炎小鼠滑膜组织炎症，改善病情，促进病症好转，这与赫军等[20]的研究中牛大力可有效改善炎症反应的结论一致。此外，本研究治疗中小鼠无明显的不良反应，牛大力在痛风性关节炎治疗中的可行性和安全性均良好，值得临床推广。
综上所述，中药牛大力应用于尿酸盐诱导小鼠急性痛风性关节炎模型中可有效缓解其滑膜细胞炎症，是急性痛风性关节炎治疗的有效中药之一。
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（收稿日期：2018-05-03 本文编辑：祁海文）