Article Info

癫痫是神经科的常见疾病之一，发作形式多样，具有很高的发病率和致残率。癫痫发作可激活神经元、神经胶质细胞等释放大量氧自由基和炎症因子，从而造成脑组织的再次损伤[1]。iNOS和COX-2是神经炎症的重要介质，在缺血、缺氧等损伤因素的作用下，参与脑组织早期炎症反应，并对神经兴奋性的增高起到重要作用[2-3]。本实验采用海人酸建立癫痫模型，探讨大黄素对小鼠癫痫发作后海马组织中iNOS、COX-2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

海人酸（批号：K0250）与大黄素（批号：E7881）均购自美国Sigma公司；兔抗鼠iNOS、COX-2多克隆抗体购自Santa Cruz公司；RT-PCR试剂盒来源于Promega公司；蛋白浓度试剂盒由碧云天生物技术研究所提供；ICR健康雄性小鼠45只[许可证号：SCXK（沪）2007-0005]，体重为23～28 g，购自上海斯莱克实验动物中心，饲养条件：常温，湿度（55±）5%，亮暗周期为 12/12 h，自由饮水和进食标准饲料。

1.2 动物模型建立及给药

将45只ICR小鼠按照随机数字表法分为癫痫持续状态（SE）组、大黄素治疗组、对照组，每组15只。采用海人酸（腹腔内注入、12 mg/kg）建立SE模型。按Racines[4]分级标准评价癫痫行为，具体如下。0级：正常行为；Ⅰ级：面部肌肉痉挛表现为咀嚼运动、眨眼、动须等，湿狗样颤动；Ⅱ级：颈部肌肉痉挛表现为点头运动；Ⅲ级：一侧前肢阵挛；Ⅳ级：站立伴双前肢阵挛；Ⅴ级：在Ⅳ级的基础上身体向后倒下失去平衡，四肢抽动。达到Ⅲ级改变以上者定为癫痫发作，连续的痫性发作＞30 min者为癫痫持续状态。模型制备成功后，大黄素治疗组立即腹腔注射大黄素200 mg/kg 1次。对照组、SE组在相同时间给予相应体积的生理盐水。

1.3 标本制备

每组取5只ICR小鼠，麻醉后心脏灌注40%甲醛后取脑，浸泡24 h。通过石蜡包埋切片，用于HE染色；每组另取10只ICR小鼠，麻醉后断头取双侧海马，分别提取总蛋白与RNA，用于Western blot与RTPCR的检测。

1.4 HE染色

石蜡切片4 μm，常规脱蜡脱水行HE染色，观察海马CA1、CA3区神经细胞的形态学变化。

1.5 RT-PCR检测iNOS和COX-2的mRNA表达

β-actin 引物序列（198bp）：5′-ATC GTG CGT GAC ATC AAA GAGA-3′（上游），5′-TGC CAC AGG ATT CCA TAC CCAA-3′（下游）。 iNOS 引物序列（314bp）：5′-CTG CAG CAC TTG GAT CAG GAA CCTG-3′（上游），5′-GGG AGT AGC CTG TGT GCA CCT GGAA-3′（下游）。 COX-2 引物序列（374bp）：5′-CCA TGT CAA AAC CGT GGT GAATG-3′（上游），5′-ATG GGA GTT GGG CAG TCA TCAG-3′（下游）。用 Trizol提取总RNA，反转录得到cDNA。热循环条件：94℃预变性4 min，94℃变性 40 s，退火（iNOS：56℃ 40 s；COX-2：64℃ 40 s），72℃延伸 1 min，32 个循环。凝胶扫描分析仪扫描凝胶，并分析iNOS、COX-2与β-actin基因谱带的积分光密度，以两者比值（即相对系数）表示mRNA相对表达水平。

1.6 Western blot检测iNOS和COX-2蛋白表达

匀浆后提取总蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。取蛋白40 μg凝胶上电泳。将蛋白转移至NC膜上，TTBS洗3次，室温下5%脱脂奶粉封闭1 h。封闭后分别加入iNOS和COX-2一抗抗体，4℃静置过夜，洗膜3次，室温下HRP标记二抗孵育1 h，洗膜3次。ECL显影剂显影，以激光扫描仪进行定量扫描。

1.7 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，组间比较采用单因素方差和Bonferroni检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学观察

各组进行药物干预后，SE组持续出现头面部肌肉抽搐、点头运动、凝视、双前肢强直，双前肢离地后肢站立，尾巴强直、转圈、尖叫、四肢及全身强直，最后跌倒无法爬起，反射消失等。4 h后症状逐渐减轻，6～24 h仍有部分小鼠出现癫痫发作。发作级别多为Ⅳ～Ⅴ级，且发作次数频繁。大黄素治疗组发作级别多为Ⅲ级以下，且发作频率减少。对照组未出现癫痫发作。

2.2 HE染色

对照组海马CA1、CA3区细胞排列整齐，形态与结构正常，着色均匀。SE组细胞结构异常，排列紊乱，核固缩深染、核仁消失、细胞排列稀疏，有的神经元肿胀，呈梭形或三角形，细胞与周围分界不清。大黄素治疗组可见少量神经元肿胀、核固缩深染等现象，较SE组有显著改善（图1）。

图1 HE染色海马CA1、CA3区神经细胞的形态学变化（400×）

2.3 iNOS和COX-2 mRNA的表达

对各组条带进行光密度分析，对照组仅有少量的iNOS和COX-2 mRNA表达；而SE组iNOS和COX-2 mRNA表达明显增多（P＜0.01）。与SE组相比，大黄素治疗后可降低iNOS和COX-2 mRNA的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）（图 2、表 1）。

图2 小鼠海马组织中iNOS和COX-2 mRNA的表达水平（RT-PCR）

表1 RT-PCR 检测 iNOS、COX-2 mRNA的相对表达（

±s）

与对照组比较，#P＜0.01；与 SE 组比较，*P＜0.05

2.4 iNOS和COX-2蛋白的表达

对照组中iNOS、COX-2蛋白的表达量均较少，SE组中iNOS和COX-2蛋白的表达量显著增加，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。与SE组相比，大黄素治疗组可显著降低iNOS和COX-2蛋白的表达量（P＜0.05）（图 3、表 2）。

图3 小鼠海马组织中iNOS和COX-2蛋白的表达水平（Western blot）

表 2 Western blot检测 iNOS、COX-2/β-actin 蛋白的相对表达（

±s）

与对照组比较，#P＜0.01；与 SE 组比较，*P＜0.05

3 讨论

炎症反应是癫痫的重要损伤机制之一，癫痫发作后可激活大量氧自由基和炎症介质的释放。炎性反应可增加神经元兴奋性、诱导神经细胞坏死与凋亡[5-6]。在高炎症因子和高兴奋性的病理情况下，神经生长因子可引起轴突出芽、异常突触形成、苔藓纤维出芽及海马硬化，最终导致或加重癫痫形成恶性循环[7]。iNOS和COX-2是神经炎症的重要介质，对癫痫发作后的炎性损伤及脑水肿的发生、发展起重要作用，抑制两者的合成，可以通过阻断NO的神经毒性、减轻血-脑脊液屏障的破坏及脑血管内皮的损伤而明显减轻脑组织的炎性损伤[8]。研究显示，癫痫发作后动物海马区域迅速蓄积大量COX-2。COX-2在癫痫中的作用主要通过降低癫痫发作的阈值，参与癫痫发作的炎症反应，并可通过P糖蛋白调控血-脑脊液屏障对药物的作用[9]。还有文献报道，大鼠在敲除COX-2基因后或应用COX-2选择性抑制剂后，都可减少癫痫发作后炎症因子的释放[10]。本研究结果显示，癫痫发作后COX-2的表达量明显增多，与文献报道一致。

一氧化合酶（NOS）有三种类型，包括神经元型（nNOS）、内皮型（eNOS）及诱导型（iNOS），前两种主要分布于血管内皮细胞、神经细胞、血管平滑肌细胞和血小板，iNOS主要分布于星形胶质细胞和小胶质细胞、血管平滑肌细胞及血管内皮细胞[11]。iNOS可在内毒素、脂多糖等外界因素的刺激下被激活，活化后的iNOS可生成大量的NO，而高浓度的NO对细胞有毒性作用[12]。研究显示，小鼠癫痫发作后iNOS mRNA的表达量显著增多，经药物干预后，iNOS含量明显减少，从而减少癫痫持续状态后对脑组织的损伤[13]。

大黄素是中药大黄的主要有效单体，具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制、抗病毒、改善微循环等作用[14-16]。最近文献报道，大黄素可减轻大鼠癫痫发作后的脑水肿，升高SOD、Na+-K+-ATP酶活性，降低MAD水平，具有脑保护作用[17]。Yang等[18]用海人酸建立大鼠颞叶癫痫模型，经腹腔注入大黄素后，大鼠癫痫发作级别降低，脑电图提示棘波、尖波等癫痫波发放减少。本研究基于上述研究基础，采用海人酸诱导小鼠癫痫持续状态模型，制模成功后，用大黄素进行干预治疗，结果显示，癫痫发作后小鼠海马内iNOS和COX-2 mRNA及蛋白的含量明显增加，与文献报道一致。大黄素治疗后能显著减少海马组织中iNOS、COX-2的表达，从而减少癫痫持续状态后对脑组织的再次损伤，具有脑保护作用。其具体作用机制有待进一步研究。

[参考文献]

[1]Vezzani A，Fujinami RS，White HS，et al.Infections，inflammation and epilepsy[J].Acta Neuropathol，2016，131（2）：211-234.

[2]Serrano GE，Lelutiu N，Rojas A，et al.Ablation of cyclooxygenase-2 in forebain neurons is neurprotective and dampens brain inflammantion after epilepticus[J].J Neurosci，2011，31（42）：14850-14860.

[3]Bahar T，Belma K，Ayse N，et al.Contribution of iNOS/sGC/PKG pathway，COX-2，CYP4A1，and gp91phox to the protective effect of 5，14-HEDGE，a 20-HETE mimetic，against vasodilation，hypotension，tachycardia，and inflammation in a rat model of septic shock[J].Nitric Oxide，2013，33（9）：18-41.

[4]RacineRJ，SteingartM，McintyreDC.Developmentofkindlingprone and kindling resistant rats：selective breeding and electrophysiological studies[J].Epilepsy Res，1999，35（3）：183-195.

[5]Annamaria V，Jacqueline F，Tamas B，et al.The role of inflammation in epilepsy[J].Nat Rev Neurol，2011，7（1）：31-40.

[6]Raimondo D，Clifford LE，Cinzia F，et al.Novel frontiers in epilepsy treatments：preventing epileptogenesis by targeting inflammation[J].Expert Rev Neurother，2013，13（6）：615-625.

[7]Maria T.Hippocampal sclerosis in epilepsy：a neuropathology review[J].Neuropathol Appl Neurobiol，2014，40（5）：520-543.

[8]Cheng O，Ostrowski RP，Wu B，et al.Cyclooxygenase-2 mediates hyperbaric oxygen preconditioning in the rat model of transient global cerebral ischemia[J].Stroke，2011，2（2）：484-490.

[9]Rojas A，Jiang J，Ganesh T，et al.Cyclooxygenase-2 in epilepsy epilepsia[J].2014，55（1）：17-25.

[10]Jiang J，Quan Y，Ganesh T，et al.Inhibition of the protaglanin receptor EP2 following status epilepticus redcues delayed mortlity and brain inflammation[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（9）：3591-3596.

[11]Harumasa N，Kyungho C，Shohei S，et al.iNOS as a driver of inflammation and apoptosis in mouse skeletal muscle after burn injury：possible involvement of sirt1 S-nitrosylation-mediated acetylation of p65 NF-κB and p53[J].PLoS One，2017，12（1）：e0170391.

[12]Iadecola C，Zhang F，Casey R，et al.Inducible nitric oxide synthase gene expression in vascular cells after transient focal cerebral ischemia[J].Stroke，1996，27（8）：1373-1380.

[13]欧阳龙强，梁日生，杨卫忠，等.黄芩苷对小鼠癫痫持续状态后海马神经细胞的保护作用[J].中华实验外科杂志，2012，29（9）：1697-1699.

[14]Park SY，Jin ML，Ko MJ，et al.Anti-neuroinflammatory effect of emodin in LPS-stimulated microglia：involvement of AMPK/Nrf2 activation[J].Neurochm Res，2016，41（11）：2981-2992.

[15]He Y， Huang J，Wang P，et al.Emodin potentiates the antiproliferative effect of interferon α/β by activation of JAK/STAT pathway signaling through inhibition of the 26S proteasome[J].Oncotarget，2016，7（4）：4664-4679.

[16]Yang F，Yuan PW，Hao YQ，et al.Emodin enhances osteogenesis and inhibits adipogenesis[J].BMC Complement Altern Med，2014，14：74.

[17]顾建文，郑崇勋，杨文涛，等.大黄素对大鼠癫痈模型的脑保护作用[J].中华神经医学杂志，2006，5（7）：676-680.

[18]Yang T，Kong B，kuang Y，et al.Emodin plays an interventional role in epileptic rats via multi-drug resistance gene 1 （MDR1）[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8（3）：3418-3425.