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青黄散全称青黛雄黄散，始载于元·孙允贤辑《医方大成》，属砷复合制剂。北京西苑医院应用其治疗包括急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）在内的多种恶性血液病已有半个世纪的历史，周霭祥等[1-3]总结得出青黄散应用于血液疾病如骨髓增生异常综合征等可有效提高缓解率、有效率等[4-5]。我科应用青黄散治疗AML、骨髓增生异常综合征、慢性粒细胞白血病等恶性血液病，亦取得相应疗效且不良反应相对较小，并观察到有部分患者疗效较佳。

青黄散组分包含靛玉红[6]（Indirubin，青黛的有效成分）和二硫化二砷（Arsenic Disulfide，As2S2，雄黄的有效成分），基础研究显示，靛玉红（Indirubin）可抑制白血病细胞增殖[7]，诱导并促进肿瘤细胞的调亡[8-9]；As2S2可诱导肿瘤细胞分化，抑制肿瘤细胞增殖，降低端粒酶活性，以诱导细胞凋亡[10-13]。靛玉红（Indirubin）与As2S2单药的研究相对透彻，两者联用的研究相对较少，且其能否对难治性AML起作用尚不清楚，白血病的复发与难治主要与白血病干细胞[14]有关，本研究以属于白血病干细胞（leukemic stem cells，LSCs）并抵抗蒽环类药物和自然杀伤作用的KG1a细胞作为研究对象，探讨单用和联用的生物导致药物相关分子变化，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1　主要材料和细胞株

人类急性髓系白血病KG1a细胞株由南方医科大学珠江医院血液科郭坤元教授惠赠；靛玉红（Indirubin，纯度95%，10mg）为上海阿拉丁公司产品；As2S2[Arsenic（Ⅱ） sulfide，tech.90%，5 g]为美国 Alfa Aesar公司产品；IMDM、胎牛血清培养基为美国Hyclone公司产品；瑞氏吉姆沙染色剂为BASO公司产品；CCK-8试剂盒为日本同仁株式会社产品；DMSO、SDS、Tris碱为美国 sigma公司产品；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒、Smac抗体、Bcl-2抗体、XIAP-1抗体、c-IAP抗体、Caspase-3抗体、β-actin抗体以及兔抗鼠抗体为美国Cell Signaling Technology公司产品；PVDF膜为美国Millipore公司产品；X曝光片为日本富士公司产品；Western blotting化学发光试剂为美国Genes公司产品。

1.2　主要设备仪器

YG-875B超净工作台（苏州医疗设备厂），电子天平AB-160型（美国Denver公司），酸度计pHS-25型（上海雷磁仪器厂），磁力搅拌器75-2型（上海市医用分析仪器厂），CO2细胞培养箱（美国Thermo公司），高速冷冻离心机（日本Hitachi公司），FACSCaliburTMBD型流式细胞仪（美国Courful公司），酶标仪Elx800（美国 Bio-Tek instruments），Olympus BH-2 倒置相差显微镜（日本Olympus公司），微型电泳及电转移系统（美国BIO-RAD公司）。

1.3　KG1a细胞的培养

KC1a细胞株培养在完全培养基（10%胎牛血清、IMDM基础培养基、1%青霉素、1%链霉素）中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。每隔1 d换液1次（半量换液或离心全量换液），密切观察细胞污染情况，取对数生长期的细胞进行实验。

1.4　10 mmol/L As2S2溶液的配制

称量2.14 g As2S2，溶解于 500 ml的 1 mol/L的NaOH溶液中，磁力搅拌器连续搅拌72 h，使用酸度计将以上溶液用1 mol/L的HCl溶液调整pH值7.35～7.45，0.22 μmol滤器过滤后即为 As2S2母液，用无菌EP管分装，于4℃冰箱保存。使用时用完全培养基稀释至实验所需浓度。

1.5　10 mmol/L Indirubin溶液的配制

称量10 mg Indirubin，溶解于3.81 ml的DMSO中，用0.22 μmol滤器过滤后产生Indirubin母液，用无菌EP管分装后避光保管于-80℃冰箱。使用时用完全培养基稀释至实验所需浓度。

1.6　细胞生长活力的检测

将1×104/ml的KG1a细胞接种到96孔板中，每孔总体积100μl，实验分空白Control组、实验对照组以及As2S2（0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1000.00 μmol/L）和Indirubin（0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1000.00 μmol/L）处理组，每组5个复孔。分别培养24、48、72、96 h后，在每孔加入 10 μl CCK-8 液后，于 37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养3 h，轻轻震荡混匀后直接在酶标仪上读取450 nm处的吸光值（OD值）。实验重复3次。细胞增殖抑制率=[1-（药物处理孔OD-空白对照孔 OD）/（实验对照孔 OD-空白对照孔 OD）]×100%。

1.7　瑞氏染色法观察细胞的凋亡形态

取对数生长期的KG1a细胞，以5×105/ml的密度接种到12孔板中，实验分10组，分别为不加药物处理的 Control组，10、50、100 μmol/L 的 As2S2处理组，10、50、100 μmol/L 的 Indirubin 处理组，10 μmol/L As2S2+10 μmol/L Indirubin 处理组，50 μmol/L As2S2+50 μmol/L Indirubin 处理组，100 μmol/L As2S2+100 μmol/L Indirubin处理组。每组3个复孔，处理48 h后以1000 r/min离心5 min收集培养皿中细胞，PBS重悬洗涤细胞1次后取一部分细胞用10 μl的胎牛细胞重悬，再迅速涂片到玻片上，室温下晾干后用瑞氏染色液滴于玻片上，再滴同样体积的去离子水，混匀，室温下染色5～10 min，冲洗染好的玻片并在倒置光学显微镜下观察细胞凋亡的形态学变化。

1.8　流式细胞术检测细胞凋亡

细胞按实验分组接种于6孔板中，实验分10个组，分别为不加药物处理的 Control组，10、50、100 μmol/L的 As2S2处理组，10、50、100 μmol/L 的 Indirubin 处理组，10 μmol/L As2S2+10 μmol/L Indirubin 处理组，50 μmol/L As2S2+50 μmol/L Indirubin 处理组，100 μmol/L As2S2+100μmol/LIndirubin处理组。每组设3个复孔，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养48 h后以1000 r/min离心5 min收集对数生长期的KG1a细胞，用预冷的PBS洗涤细胞3次，1000 r/min离心5 min，再加入500 μl的 Binding Buffer重悬细胞，接着加入 5 μl AnnexinⅤ-FITC混匀后，再加入5 μl PI混匀，在室温下、避光5～15 min，在1 h内进行流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.9　Western blot检测凋亡蛋白

收集根据实验分组作用48 h后的KG1a细胞，加入蛋白裂解液在冰上裂解收集上清液；再进行SDSPAGE电泳和转膜，牛奶封闭后加入相应的单抗孵育2 h，PBS洗涤牛奶封闭的膜条3遍，之后结合HRP-二抗，用于检测 β-actin、BCL-2、XIAP-1、c-IAP、Caspase-3、Smac蛋白表达；最后化学发光显影、扫描分析。

1.10　统计学方法

本研究中所有需要进行统计学分析的实验都设置了至少3个复孔并实验重复3次，采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（

±s）表示，不同浓度的药物对细胞的增殖抑制实验采用重复测量的方差分析，细胞凋亡采用单因素方差分析，方差齐时组间多重比较采用LSD法；方差不齐时，组间多重比较采用 Dunnett′s T3法，以 P＜0.05为差异有统计学意义。联合药物的协同作用应用CompuSyn软件进行分析，联合指数（combination index，CI）＜0.9表示协同作用，0.9≤CI≤1.1 为叠加作用，CI＞1.1表示拮抗作用。

2　结果

2.1　细胞毒作用

2.1.1　Indirubin对KG1a细胞的增殖抑制作用　KG1a细胞经 Indirubin （0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1000.00 μmol/L）分别处理 24、48、72、96 h 后（实验重复3遍），上述浓度处理KG1a细胞24 h和48 h后，细胞抑制率较Control组升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），且随浓度上升，细胞抑制率无明显变化；上述浓度处理72 h和96 h后，细胞抑制率与Control组相比明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），但随浓度升高，细胞抑制率无明显变化；KG1a细胞经相同浓度Indirubin处理24、48 h后，细胞抑制率与Control组比较差异无统计学意义（P＞0.05），经相同浓度Indirubin处理72、96 h后，细胞抑制率与Control组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；相同浓度Indirubin处理KG1a细胞24 h和处理72、96 h比较，细胞抑制率差异有统计学意义（P＜0.05），相同浓度Indirubin处理KG1a细胞48 h和处理72、96 h比较，细胞抑制率差异有统计学意义（P＜0.05）（图 1）。

图1　Indirubin对KG1a细胞株的增值抑制作用

2.1.2　As2S2对KG1a细胞的增殖抑制作用 KG1a细胞经 As2S2（0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1000.00 μmol/L）分别处理 24、48、72、96 h 后（实验重复 3 遍），上述浓度处理KG1a细胞24、48、72、96 h后，细胞抑制率较Control组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；As2S2在0.01～100.00 μmol/L 处理 KG1a细胞 24 h 和 48 h，随着浓度增加，细胞抑制率变化不明显；在1000.00 μmol/L处理KG1a细胞24 h和48 h，细胞抑制作用较0.01～100.00 μmol/L 明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；As2S2在0.01～1.00 μmol/L之间处理KG1a细胞72 h和96 h，随着浓度增加，细胞抑制率变化不明显；在10.00～1000 μmol/L之间，随着浓度增加，细胞抑制率增加明显，差异有统计学意义（P＜0.05）；低浓度（0.01～1.00 μmol/L）作用 KG1a细胞，随时间延长，细胞抑制作用不明显，高浓度（10.00～1000.00 μmol/L）作用KG1a细胞，随时间延长，细胞抑制作用明显，抑制率差异有统计学意义（P＜0.05）（图 2）。

图2　As2S2对KG1a细胞株的增值抑制作用

2.1.3　As2S2联合Indirubin对KG1α细胞的增殖抑制作用　根据As2S2、Indirubin单药对KG1a细胞的增殖抑制作用，利用SPSS 20.0计算出As2S2各试验时间段 CI50为 1～1000 μmol/L，且 Indirubin 对 KG1a 细胞的增殖抑制作用具有时间依赖性，选择As2S2低、中、高三个浓度（10、50、100 μmol/L）单药及分别联合Indirubin 低、中、高三个浓度（10、50、100 μmol/L），共作用于KG1a细胞株48 h，采用CCK8法检测细胞抑制率（实验重复3遍），结果显示，三组As2S2单药及三组As2S2分别联合 Indirubin 三个浓度（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L）的细胞抑制率均较 Control组上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；低浓度 As2S2与低、中、高浓度Indirubin组合后，A、B、C、D各组细胞存活率分别为（0.150±0.033）%、（0.195±0.119）%、（0.178±0.055）%、（0.203±0.040）%，A、B、C、D 各组的细胞抑制率差异无统计学意义（P＞0.05）；中浓度 As2S2与低、中、高浓度Indirubin组合后，E、F、G、H各组细胞抑制率分别为（0.215±0.034）%、（0.256±0.108）%、（0.557±0.045）%、（0.628±0.080）%，E和F的细胞抑制率差异无统计学意义（P＞0.05），E和G、H的细胞抑制率差异均有统计学意义（P＜0.01），中浓度As2S2联合不同浓度Indirubin的细胞抑制率有差异，其中F和G、F和H之间的差异有统计学意义（P＜0.01）；高浓度 As2S2与低、中、高浓度Indirubin组合后，I、J、K、L各组细胞抑制率分别为（0.456±0.093）%、（0.675±0.123）%、（0.754±0.056）%、（0.777±0.039）%，I和 J、K、L 的细胞抑制率差异均有统计学意义（P＜0.01）（图 3）。通过 CompuSyn 软件分析As2S2和Indirubin以1︰1组合对KG1a细胞株的CI，10 μmol/L As2S2+10 μmol/L Indirubin 的 CI 值　为0.40，50 μmol/L As2S2+50 μmol/L Indirubin 的 CI值为0.25，100 μmol/L As2S2+100 μmol/L Indirubin 的 CI值为0.15，两药经1︰1联合处理后的CI值均＜0.9，提示As2S2和Indirubin具有协同作用。

图3　As2S2联合Indirubin对KG1a细胞的增殖抑制作用

2.2　细胞凋亡形态学的变化

通过瑞氏吉姆萨染色观察As2S2、Indirub in单药及两药联合对KG1a细胞株作用48 h后细胞凋亡的形态学变化。Control组细胞形态规则，细胞呈圆形或类圆形，表面光滑，染色质疏松、胞质少。Indirubin低、中、高浓度（10、50、100 μmol/L）单药处理 KG1a 细胞株作用48 h后，细胞形态变化不大，大致类圆形，但部分细胞胞质可见少量空泡（箭头所示）；As2S2低、中、高浓度（10、50、100 μmol/L）单药处理 KG1a 细胞株作用48 h后，细胞形态随As2S2浓度增加而不规则，部分细胞边缘不齐、肿胀，伴细胞质空泡形成、细胞核固缩（箭头所示）；As2S2低、中、高浓度分别联合Indirubin低、中、高浓度对KG1a细胞株作用48 h后，细胞形态随联合药物浓度增加而不规则，大部分细胞边缘不齐，细胞空泡化随联合药物浓度增加，染色质固缩随联合药物浓度增加而增加（箭头所示）（图4）。联合药物组对KG1a细胞株作用后细胞凋亡形态对比Control组及As2S2、Indirubin单药组更加明显。

图4　KG1a细胞凋亡形态比较（瑞氏染色 1000×）

A.Control；B.Indirubin 10 μmol/L；C.Indirubin 50 μmol/L；D.Indirubin 100 μmol/L；E.As2S210 μmol/L；F.As2S250 μmol/L；G.As2S2100 μmol/L；H.As2S210 μmol/L+Indirubin 10 μmol/L；I.As2S250 μmol/L+Indirubin 50 μmol/L；J.As2S2100 μmol/L+Indirubin 100 μmol/L

2.3　流式技术检测细胞凋亡率的变化

通过流式细胞仪，进一步验证As2S2、Indirubin单药及As2S2联合Indirubin对KG1a细胞株作用48 h后的细胞总凋亡率的变化。结果显示，As2S2，Indirubin各低、中、高单药组及As2S2低、中、高浓度对应联合Indirubin低、中、高浓度作用于KG1a细胞株作用48 h后的细胞总凋亡率均较Control组升高，低浓度Indirubin（A）和中浓度 Indirubin（D）的 KG1a 细胞总凋亡率与Control组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其余单药浓度（B、E、G、H）和联合药物（C、F、I）的KG1a细胞总凋亡率与Control组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；低、中、高浓度 As2S2对应联合低、中、高浓度Indirubin的KG1a细胞总凋亡率分别为（68.47±0.85）%、（77.63±0.74）%、（81.53±0.86）%，均较低、中、高浓度As2S2和低、中、高浓度Indirubin的KG1a细胞总凋亡率明显上升，差异有统计学意义（P＜0.01）（图 5）。

图5　KG1a细胞总凋亡率比较（流式）

A.Control；B.Indirubin 10 μmol/L；C.As2S210 μmol/L；D.As2S210 μmol/L＋Indirubin 10 μmol/L；E.Indirubin 50 μmol/L；F.As2S250 μmol/L；G.As2S250 μmol/L＋Indirubin 50 μmol/L；H.Indirubin 100 μmol/L；I.As2S2100 μmol/L；J.As2S2100 μmol/L＋Indirubin 100 μmol/L

2.4　免疫印迹分析相关凋亡蛋白的影响

为研究As2S2联合Indirubin的相关凋亡机制，利用 Western blot探究 50 μmol/L As2S2单药、50 μmol/L Indirubin单药和两者联合对KG1a细胞株作用48 h后的细胞相关凋亡蛋白的表达变化，结果显示，各组β-actin蛋白表达无明显差异；Indirubin单药对KG1a的促凋亡蛋白Caspase-3和Smac表达较对照组上升，抑凋亡蛋白BCL-2、XIAP-1、c-IAP与对照组基本一致；As2S2单药对KG1a的促凋亡蛋白Caspase-3和Smac表达较对照组和Indirubin单药上升，抑凋亡蛋白BCL-2、XIAP-1、c-IAP较对照组下降；两药联合后，KG1a的促凋亡蛋白Caspase-3和Smac表达较对照组和单药组明显上升，抑凋亡蛋白BCL-2、XIAP-1、c-IAP较对照组和单药组明显下降（图6），提示As2S2联合Indirubin能上调KG1a的促凋亡蛋白表达，下调KG1a的抑凋亡蛋白表达（该步实验结果未行荧光灰度扫描）。

图6　KG1a细胞凋亡蛋白的变化（Western blot）

3　讨论

青黄散全称青黛雄黄散，始载于元·孙允贤辑《医方大成》，文中记载“诸凡始觉中毒、及蛇虫咬、痈疽才作”，即取青黛、雄黄等分，研为细末，取新汲水调服二钱，可“令毒瓦斯不聚”；至明·董宿著《奇效良方》中，文中亦载“凡始觉中毒，意思不快，胸腹脏闷，即服此药，毒瓦斯不聚”的相关条文。方中青黛性寒，味咸，主入肝经，历代文献如《开宝本草》《本经逢原》等均谓其可除热解毒，兼能凉血，用治温毒发斑，具有消肿散瘀、凉血解毒之效；雄黄性温，味辛，归肝、大肠经，首以“黄食石”之名始于《神农本草经》，历代文献如《药性论》《本草纲目》等均言其乃治疮杀毒要药，尤重描述雄黄的纯阳之性与化瘀之效，具有可消积聚，解百毒，化腹中之瘀血之功。青黛、雄黄两者一寒一温相须而用，青黛配雄黄，借雄黄之阳热可防青黛苦寒败胃；雄黄配青黛，借青黛入血分之效引雄黄入骨髓以增强雄黄杀髓毒之功，又能除雄黄温热之弊，两者联用，可奏温扶元阳、解毒化瘀之功效，与扶正祛邪的思想相合。目前，有研究显示，应用青黄散于血液病能够取得一定疗效[15-16]。我科前期研究发现砷制剂如三氧化二砷对KG1a细胞具有抑制增殖及诱导凋亡作用[17]，也有青黄散临床应用于AML、骨髓增生异常综合征、慢性粒细胞白血病等恶性血液病经验，并取得一定疗效。

KG1a细胞株与白血病干细胞免疫表型相一致，细胞膜表面表达CD34＋和 CD123＋，包含有（54.167±6.57）%CD34＋CD38－细胞，是目前公认的白血病干细胞株。研究显示，KG1a细胞表现出了干细胞特性的无限增殖、自我更新能力[18-21]。为初步探究青黄散对白血病干细胞的作用机制，本研究选用KG1a细胞株为研究对象，应用青黄散组分Indirubin和As2S2分别及联合作用于白血病干细胞株KG1a，观察其作用于KG1a细胞株的细胞毒作用、细胞形态变化、细胞凋亡程度及凋亡蛋白变化。

细胞毒实验显示，Indirubin对KG1a细胞株连续作用72 h以上具有增殖抑制作用，不具有浓度依赖性，提示提高Indirubin浓度不能提高增殖抑制作用，且连续作用72 h后增殖抑制作用明显提高；As2S2对KG1a细胞具有增殖抑制作用，呈时间-浓度依赖性，提示As2S2的剂量越大、作用时间越长，细胞的增殖抑制作用越强；说明Indirubin和As2S2均能不同程度抑制KG1a细胞的增殖。

单独用药与联合用药相比较，根据元·孙允贤辑《医方大成》，将Indirubin和As2S2以1︰1的不同浓度配合作用于KG1a细胞48 h后观察其相关指标变化。两药联合的细胞抑制率均较Control组上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；两药经1︰1联合处理后的CI值均＜0.9，提示As2S2和Indirubin具有协同作用。同时，在细胞凋亡形态方面，与单药相比，As2S2联合Indirubin对KG1a细胞株作用48 h后，细胞形态随联合药物浓度增加而不规则，大部分细胞边缘不齐，细胞空泡化随联合药物浓度增加，染色质固缩随联合药物浓度增加而增加，提示两种药物联合可诱导白血病细胞发生凋亡。活细胞流式细胞检测技术可根据细胞凋亡不同阶段所表达的不同特征检测细胞凋亡阶段的发生。流式实验结果显示，Indirubin单药对于KG1a细胞株的促凋亡作用不明显，As2S2单药主要促进KG1a细胞株发生晚期凋亡，两药联合促进KG1a细胞的发生早期凋亡，从而提高肿瘤细胞的凋亡率。研究显示，磷脂酰丝氨酸外翻机制主要与细胞内ATP缺乏、胞浆Ca2＋浓度升高、活性氧浓度过高、肿瘤内皮细胞因子的激活或物理性损伤等有关[22]。As2S2联合Indirubin后明显促进磷脂酰丝氨酸外翻，可推知其促进肿瘤细胞凋亡或许与促进细胞外Ca2＋内流、影响胞内ATP的合成、促进活性氧内流等有关。凋亡蛋白方面，通过Western blot发现As2S2联合Indirubin作用KG1a细胞48 h后，两药联用可显著提高促凋亡蛋白（Caspase-3和Smac）表达，明显下调抑凋亡蛋白（BCL-2、XIAP-1、c-IAP）表达。Smac的表达提高，可特异性地结合IAPs对下游效应Caspase的抑制[23-25]，具体表现为Smac提高，特异性结合IAPs，使XIAP和c-IAP表达下调，引起下游Caspase-3表达提高当细胞发生早期凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻时，也会出现Caspase的活化，可见总体Caspase-3表达增多，同时BCL-2表达下调，总体促凋亡蛋白表达增多、抑凋亡蛋白表达减少，共同引起细胞通过线粒体途径凋亡。

综上所述，As2S2联合Indirubin具有协同作用，此协同作用具有浓度依赖性；As2S2联合Indirubin对KG1a细胞株具有明显的抑制存活和促凋亡作用；As2S2联合Indirubin可诱导白血病细胞发生内源性线粒体途径凋亡，与促凋亡蛋白（Caspase-3和Smac）表达上升和抑凋亡蛋白（BCL-2、XIAP-1、c-IAP）表达下降有关；As2S2联合Indirubin后促凋亡作用提高，为“雄黄与青黛一热一寒、一阳一阴的配伍，具有温而不燥、寒而不凝之功，可奏温扶元阳、鼓舞气血、攻毒化瘀、消积散聚之效”的中医传统理论提供实验数据支持，为实验性治疗难治/复发的AML及转化医学治疗恶性血液病提供实验基础。

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