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转化生长因子-β（TGF-β）具有多种生物学功能，促纤维化是其最重要的功能之一，被大多数学者公认为纤维化形成与发展的启动枢纽[1-3]。TGF-β的活化过程是其发挥正常功能的关键步骤，是一个受多种因素影响的复杂过程，在纤维化性疾病的发生、发展中起重要作用[4-6]。TGF-β的活化在细胞外完成，是受多种因素影响的复杂过程。在胞内，TGF-β的各种异构体都是由各个独立基因产生的，先是被合成前体蛋白，然后在内肽酶、Furin酶作用下产生TGF-β蛋白N端的二聚体潜在相关肽（LAP）和C端的二聚体成熟型TGF-β，这两部分以非共价形式相连，即TGF-β与LAP的复合物，它不具有生物活性[7-9]。LAP上的半胱氨酸富集区能够结合TGF-β功能区，并且LAP上具有结合潜在TGF-β结合蛋白（LTBP）和整合素的识别区域[10-11]，TGF-β与LAP的复合物被分泌到细胞外后，经过复杂的过程，并在LTBP、整合素、BMP、活性氧等的作用下，LAP被祛除或发生构型改变，导致复合物瓦解，方可释放具有生物活性的TGF-β，TGF-β通过与细胞膜表面特异性受体结合才能发挥生物学效应[12-15]。本实验以人源LAP蛋白为研究对象，希望构建一种能与TGF-β高效结合的截短型LAP片段，即能高效地与野生型LAP竞争结合TGF-β，在TGF-β活化的起始阶段干扰TGF-β的活化，进而抑制TGF-β信号传导。

1　材料与方法

1.1　试剂与仪器

质粒小提试剂盒、DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；RNA提取试剂盒购自上海拜力生物科技有限公司；PCR相关试剂购自日本东洋纺公司；Xho lⅠ、Eco RⅠ、T4连接酶及Buffer购自宝生物工程大连有限公司；引物、非干扰型蛋白定量试剂盒、W-TMB显色试剂盒均由上海生工生物工程股份有限公司产品。PCR仪，离心机，均为德国Eppendorf公司产品。

1.2　人源LAP截短型片段的扩增

依据Gene Bank数据库中LAP的cDNA序列设计引物，为方便克隆在上下游引物的5′端加入XholⅠ和Eco RⅠ的酶切位点，上游引物5′-AGTGGACATCAACGGGTTC-3′，下游引物 5′-CCAGTGTGTTATCCCTGCT-3′。按RNA提取试剂盒提人血总RNA，逆转录成cDNA，并以此为模板扩增基因片段。反应条件为：95℃预变性 5 min，95℃变性 30 s，55℃复性 30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸5 min。

1.3　原核表达载体的构建

扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离后，用DNA回收试剂盒回收产物，回收的基因和载体pET28a分别用限制性内切酶XholⅠ、Eco RⅠ双酶切。回收酶切产物后连接载体与基因片段，得到pET28a-LAPB2重组质粒。将重组质粒转化至感受态DH5α，将连接产物涂布于卡那霉素抗性的LB平板培养基上，烘箱37℃培养12 h。挑取单克隆菌落摇菌过夜，抽提质粒进行双酶切鉴定，并将阳性克隆测序。

1.4　重组蛋白的原核表达

将测序正确的重组质粒转化至感受态大肠埃希菌BL21，挑取单菌落于 5 ml LB培养基中，37℃，220 r/min过夜培养。将过夜培养的菌液按1∶100比例分别接种于10 ml的LB培养基中，37℃，220rpm震荡培养至OD值为0.6时，添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，220 r/min，分别 20℃诱导过夜，37℃诱导 4 h，未加IPTG组为阴性对照，选择最佳的诱导条件。诱导后收集菌体用PBS缓冲液悬浮，超声破碎菌体，离心分别收集上清和沉淀，沉淀用包涵体溶解液溶解，用12%的SDS-PAGE胶电泳检测，电泳结束后用考马斯亮蓝染色。

1.5　重组蛋白的纯化

按表达量最高的条件大量诱导表达重组蛋白后，用PBS将收集的菌体重悬，冰浴超声破碎菌体，12 000 r/min，4℃，离心 20 min，收集上清进行纯化。用镍琼脂糖亲和层析法纯化，用20、50、500 mmol/L的咪唑梯度洗脱，将收集到的组分进行SDS-PAGE检测，将纯度最好的洗脱组分经透析膜透析2 h后再经滤膜过滤、分装，-80℃保存。SDS-PAGE电泳和Western blot检测纯化后的蛋白，并使用SK3071非干扰型蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.6　大鼠肝星状细胞-T6（HSC-T6）的增殖检测

MTT实验设有正常对照组、模型组、重组蛋白作用组 7 组（5、10、25、50、75、100、200 ng/ml）、空白对照组，除正常对照组和空白组外，其他组均加入10 ng/ml的 TGF-β活化细胞。每组5个复孔，按每孔8×103细胞种至3个96孔板中，培养至贴壁后加入药物，分别培养 12、24、48 h，每孔加入 20 μl 5 mg/ml MTT，培养4 h后弃培养液，加入150 μl DMSO震荡10 min，用酶联仪测试490 nm处吸光度值（OD）。

2　结果

2.1　LAP截短片段的扩增

人源LAP片段为747 bp，实验设计的截短片段为171 bp，PCR扩增后，结果显示产物条带大小为171 bp，与实验设计一致（图1）。

图1　PCR扩增产物电泳

M 为 protein marker，1为 LAP-B2片段

2.2　原核表达载体鉴定

抽提阳性克隆菌液质粒，用Xhol I、EcoR I双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测显示，分别产生171 bp和5369 bp的条带，与目的片段和载体大小相符（图2）。阳性克隆重组质粒送于上海生工生物工程有限公司测序，测序结果表明插入的序列与Genebank公布的序列一致（图3）。

图2　重组质粒酶切鉴定

M为protein marker，2和3为重组质粒酶切

图3　运用BLAST软件对比插入的LAP序列

2.3　重组蛋白的表达和纯化

经IPTG诱导表达，发现重组蛋白以包涵体形式大量存在于37℃诱导4 h的菌体沉淀中（图4），分子量大小为10.3 KD，与预期目的蛋白分子量一致，可进一步纯化。将收集的菌体用破碎Buffer溶解（2 mmol/L咪唑，50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，0.1%Triton X-114，1 mmol/L DTT，pH 8.0），冰浴超声破碎菌体，用镍柱纯化重组蛋白，利用咪唑梯度洗脱，收集洗脱液。SDS-PAGE检查从包涵体中纯化出了目的蛋白（图5）。

图4　重组蛋白小试SDS-PAGE图

M 为 protein marker，1为诱导前总蛋白，2为 20℃上清，3为 20℃沉淀，4为37℃上清，5为37℃沉淀

图5　蛋白纯化SDS-PAGE分析图

M为protein marker，1为上样，2为流出，3为20 mmol/L咪唑流穿组分，4为50 mmol/L咪唑洗脱组分，5为500 mmol/L咪唑洗脱组分

重组蛋白经过纯化，SDS-PAGE电泳分析在相应位置出现明显条带，表明重组蛋白成功得到了纯化（图6）。蛋白经Westernblot检测在相应位置出现明显条带（图7），用W-TMB显色试剂盒显色，经测定蛋白浓度＞85%。

图6　蛋白最终纯化SDS-PAGE图

M为protein marker；1为目的蛋白

图7　蛋白最终纯化WB图

M为protein marker；1为目的蛋白

2.4　MTT检测细胞增殖结果

不同浓度的重组蛋白作用于HSC-T6细胞，不同时间测其OD490值，其OD490值均低于TGF-β活化组，并随重组蛋白浓度加大，作用时间的延长，其OD490值逐渐降低，呈现时间-剂量依赖性（图8）。

图8　不同时间不同浓度重组蛋白对HSC-T6细胞的影响（μg/m l）

3　讨论

TGF-β具有广泛的生物学功能，TGF-β的活化过程是其发挥正常功能的关键步骤，是一个受多种因素影响的复杂过程[16-17]。本试验以TGF-β活化过程的相关蛋白LAP为研究对象，构建了LAP片段的原核表达载体，经IPTG诱导，重组蛋白在包涵体中大量表达，包涵体表达能在一定程度上保持表达产物的结构稳定[18-20]，并从包涵体中成功纯化出目的蛋白，用Western blot确定了表达的特异性，并对蛋白的表达和纯化条件进行了优化，经纯化后获得了纯度>85%的重组蛋白。将重组蛋白作用于HSC-T6细胞，发现其显著抑制了该细胞的增殖，这为后续研究人源LAP片段重组多肽对TGF-β活化过程的干扰，以及研究其对TGF-β生物学功能的影响提供有利的保障，并为纤维化疾病的研究和治疗提供新思路。

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