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结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是一种生长缓慢、通过飞沫经呼吸道传播引起人类结核病的病原菌。世界卫生组织（WHO）2017年的报告[1]指出，结核病仍然是全球头号传染病，虽然近年来抗结核进展显著，但形势依然严峻。2016年我国新增结核病人89.5万，报告病例78.3万例。根据《中华医学会.结核病分册》对结核病诊断的规定，其诊断方法包括病原学、免疫学、放射学、组织学、分子生物学诊断等，其中病原学诊断是结核病的诊断金标准。但MTB痰涂片检出率低，培养周期长，不利于早期诊断和预防治疗。WHO推荐的PCR法或快速液体培养法需要昂贵设备和严格的实验室条件，广大基层结核病实验室条件尚不能满足此类方法的开展。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal ampli fication，LAMP）为一种新型的核酸等温扩增方法。这种方法是通过BstDNA链置换聚合酶对目的基因的6个不同区域设计的3对引物（内引物、外引物、环引物）在60～65℃恒温条件下1 h内进行109～1010倍扩增[2-3]。由于其特异性强，扩增效率高，不需要昂贵设备等多方面的优势备受人们的关注。本研究应用LAMP检测方法对临床样本中的MTB 16S rDNA进行扩增，为其在基层医疗机构中应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源本实验使用的标本均来源于吕梁市人民医院检验科2017年1～12月收集的标本共89例。提供标本的患者均经痰涂片和胸片检查诊断为结核病。另外收集医院非结核患者标本的痰液20份，作为阴性对照。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者均签订《知情同意书》。MTB标准菌株H37RV由吕梁市疾控中心惠赠。

1.1.2 主要试剂与仪器罗琴培养基（珠海贝索生物科技有限公司），甜菜碱（Sigma公司），Bst大片段DNA聚合酶（NEB公司），DNA Marker,dNTP（大连宝生物工程有限公司），SYBR GreenⅠ（Thermo fisher公司），结核分枝杆菌核酸试剂盒（中山大学迪安基因有限公司），恒温水浴箱（上海精密仪器仪表有限公司），UVP凝胶成像系统（美国BioSpectrum公司）。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养及DNA模板的制备将痰液分为两份。一份接种于罗琴培养基上；另一份用4%的NaOH污染。按照MTB核酸检测试剂盒说明书提取DNA。

1.2.2 LAMP试验引物本研究中所用引物是针对MTB 16S rDNA设计3对引物，引物序列参考Pandey等[4]报道。

表1 LAMP实验引物

1.2.3 LAMP反应体系与反应条件 25 μlLAMP体系包括：外引物（F3 和 B3）各 0.2 μmol/L，内引物（FIP和 BIP）各 1.6 μmol/L，甜菜碱 1.6 mol/L，6 mmol/L Mg2SO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 U Bst DNA 聚合酶 1 μl、2.5×的 buffer，2 μl模板 DNA。将反应管置于 62℃恒温水浴箱内反应 1 h后，于80℃10 min终止反应。

1.2.4 LAMP检测的特异度以MTB H37RV为阳性对照，以灭菌双蒸水为阴性对照，以从临床非结核病患者中分离的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、鲍曼不动杆菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌的DNA为模板进行扩增。分别取5 μl扩增产物，于2%琼脂糖凝胶中电泳后，UVP拍照，出现LAMP特征性梯状条带为阳性结果，无梯状条带为阴性结果。

1.2.5 LAMP反应的灵敏度 NanoDrop超微量紫外分光光度计对H37RV的DNA定量测定，双蒸水调整浓度至1×108/ul，倍比稀释，以稀释后梯度DNA为模板，进行LAMP扩增，琼脂糖凝胶电泳验证。

1.2.6 LAMP的临床评价对临床收集的89例MTB患者的痰液DNA和20例非结核病患者的痰液DNA进行LAMP扩增，将LAMP扩增结果与罗琴培养基培养结果进行一致性比较。一致性评价：Kappa值0.00～0.40为一致性较差，0.41～0.60为一致性一般，0.61～0.80为一致性较高，0.81～1.00为几乎完全一致。

2 结果

2.1 LAMP的特异性

用LAMP检测MTB H37RV与其他非结核病肺炎患者的痰液结果如图1所示，可以看出，只有H37RV有梯度条带出现，其他菌株未出现梯度条带。综上此方法在MTB检测中具有高度特异性。

图1 LAMP特异性检测结果

M：2000DL Marker；1：阴性对照；2：H37RV；3：肺炎克雷伯菌；4：大肠埃希菌；5：铜绿假单胞菌；6：沙门菌；7.鲍曼不动杆菌; 8：李斯特菌；9：金黄色葡萄球菌；10：肺炎链球菌

图2 LAMP检测灵敏度电泳结果

M：2000DL Marker；1：阴性对照；2：1×108copies；3：1×106copies，4：1 ×105copies；5：1 ×104copies；6：1 ×103copies；7：1 ×102copies；8：50 copies；9：10 copies ；10：1 copies

2.2 LAMP的灵敏度

将提取的MTB标准菌株的DNA进行倍比稀释，用LAMP进行扩增，结果如图2所示。从图可知，电泳后的产物呈阶梯状条带，在第8泳道仍可显现，说明LAMP的检测限为50 copies。

2.3 LAMP检测临床标本的部分结果

LAMP检测临床结核阳性标本的部分结果（图3），其中7号和10号未出现扩增条带。可视性检测结果（图4）所示：反应管内液体绿色为阳性，橙色为阴性。

图3 LAMP检测临床标本的部分结果

1.阴性对照；2～11均为临床结核阳性标本，其中7、10未见扩增条带

图4 LAMP检测的颜色验证结果

1.阴性对照；2.阳性标本未出现阳性结果；3～6为阳性标本阳性结果

2.4 LAMP的临床评价

对临床收集的89例MTB患者的痰液DNA和20例非结核病患者的痰液 DNA进行LAMP扩增，将LAMP扩增结果与罗琴培养基培养结果进行一致性比较，所得实验结果如表2所示，特异性和灵敏性分别为85.00%、96.63%，对这两种方法经一致性检验后比较，差异无统计学意义（P>0.05），由 Kappa值=0.82可知，两种方法的一致性良好。

表2 LAMP与金标准的一致性比较

3 讨论

LAMP技术自2000年日本人发明以来，己经在许多领域得到了很好的发展，如大肠杆菌[5]、沙门菌[6]、金黄色葡萄球菌[7]、螺旋体[8]、支原体[9]、病毒[10-11]等病原生物体的检测文献相继被报道。据国内学者胡宗悦报道[12]，在 PubMed上发表的关于LAMP的文献约有1622篇，在CNKI上约为4220篇，可以看出LAMP检测技术已成为一种工具，广泛应用于医疗、动植物、基础、食品水产和环境等方面。与其他技术相比，LAMP检测技术具有以下优势：①LAMP检测技术不像PCR需要变性、退火和延伸等步骤对温度的精确控制，只用一台恒温水浴箱即可完成实验，所用设备廉价、操作简单；②LAMP检测技术针对靶基因设计4条引物，再增加2条外引物，可使得其扩增时间缩短到1 h内，极大地提高了扩增效率；③在LAMP扩增过程中产生大量的焦磷酸根离子，可与SYBR GreenⅠ发生显色反应[13]，可通过观察反应体系颜色变化来快速判断产物的生成。

本实验利用LAMP检测目的基因的特异性为100%，这可能与LAMP在设计时有6条引物，使用6条引物的LAMP扩增特异性高于其他检验方法。在LAMP灵敏性方面，其最低限为50 copies，此结果与国内学者报道的基本一致[14]。在临床评价实验中3例为阴性，其原因可能是引物设计针对H37RV的保守基因，而临床标本可能存在基因位点突变。20例非结核病患者痰液中，有3份为阳性结果，这可能有两个原因，一是在标本大量扩增时产生了气溶胶，实验环境有可能受到污染，造成结果的假阳性；另外就是培养法只能对活菌进行培养。而LAMP对没有活性的菌株也能进行扩增[15]，所以会造成LAMP检测阳性而培养法为阴性。

综上所述，LAMP方法检测特异性强，灵敏度高，不需要昂贵的仪器设备，操作简单，耗时较少。将在基层卫生医疗单位的快速检测方面有着广阔的应用前景。

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