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脑缺血/再灌注（ischemia/reperfusion injury，I/R）损伤涉及多种病理机制，越来越多的论据表明，细胞凋亡（apoptosis）在脑I/R损伤中发挥重要的作用。二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）是一种具有多种药用价值的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性[1]。本课题组前期研究发现，DMY对于小鼠急性局灶性脑 I/R损伤，可以起到抗氧化、抗炎的保护作用[2-3]。本研究采用改良线栓法制备小鼠脑I/R损伤模型，观察DMY对脑I/R损伤后细胞凋亡及凋亡相关因子Bax、Bcl-2蛋白和基因表达的影响，进一步研究DMY对急性脑I/R损伤的抗细胞凋亡的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

体重为25～30 g的SPF级雄性昆明种小鼠，由广西医科大学实验动物中心提供并有合格证号：SCXK桂2014-0002。

1.2 主要药品与试剂

DMY（购于西安开来生物工程有限公司，纯度98.33%，批号K130311），临用前用0.5%羧甲基纤维素钠配成50 mg/ml混悬液。异氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，批号217151201）。原位缺口末端标记（TUNEL）凋亡检测试剂盒（Roche，瑞士）。兔抗鼠Bax和Bcl-2一抗（北京博奥森）；SP免疫组化检测试剂盒（北京中杉）；β-actin、Bax 和 Bcl-2 引物（Takara）；RNAiso Plus Total RNA提取试剂盒，PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser（perfect real time）逆转录试剂盒，SYBR

PremixExTaqTMⅡ（TliRNaseHPlus）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒（Takara）。

1.3 主要仪器设备

R580动物麻醉机（瑞沃德生命科技有限公司）；XTZ-D体式显微镜（上海光学五厂）；DMR+Q550病理图像分析仪（德国Leica）；7300实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.4 动物分组和给药方法

42只昆明小鼠随机分成3组，即动物假手术组、I/R动物模型组和DMY（500 mg/kg）组，每组14只。DMY组在造模前，每天1次，连续10 d相同时间段，灌胃给予DMY 500 mg/kg，而后在缺血前1 h给药1次，再灌注后12 h再灌胃1次；动物假手术组和I/R动物模型组相同时间段灌胃等同体积的0.5%羧甲基纤维素钠。

1.5 小鼠局灶性脑I/R损伤模型制备

局灶性脑I/R模型通过改良线栓法建立和完善[4]。准备好解剖显微镜和器械，麻醉后镜下小心剪开颌骨下皮肤并利用微型剪慢慢剥离，在靠近气管旁找到左颈总动脉，完全剥离出至少3 cm的长度，而后先在动脉下先穿过3根结扎线，最下边的线结扎靠近近心端的动脉段，最上边的线放在最远离心脏的动脉端，利用微型剪在动脉中间位置剪开约1/2大小的口子，开始插入带有硅胶润滑头部的线栓（直径为0.20～0.23 mm）约0.6 cm后，稍改变方向后再插入0.2～0.3 cm后用预先放好的结扎线固定。在缺血3 h后，利用同法拨出线栓后结扎颈总动脉，经过24 h缺血再灌注后行多聚甲醛灌注取脑。假手术组镜下小心分离并结扎左颈总动脉，不需要插线栓。

1.6 TUNEL法测凋亡

脑细胞凋亡再灌注24 h后，每组取6只小鼠，用4%多聚甲醛灌注心脏至全身后取脑，继续放于多聚甲醛中固定24 h以上。取缺血区脑组织约3 mm大小进行酒精梯度浓度脱水，用石蜡法包埋好组织，以切片机切出每张厚度为4 μm的薄切片。进行苏木精-伊红染色后，在光学显微镜下观察脑组织缺血灶的病理性变化；根据TUNEL试剂盒步骤和方法进行脑组织的细胞凋亡染色。每只小鼠随机挑选缺血脑组织的周边区4个互不重叠的400倍高倍视野，分别对细胞核总数和凋亡细胞核数计算，并计算凋亡阳性细胞率（%）。凋亡阳性细胞率（%）=（凋亡阳性细胞数/总计数的细胞数）×100%。凋亡阳性细胞数和总计数的细胞数由病理图像分析仪分析计算。

1.7 免疫组织化学法测定蛋白表达

按试剂盒说明书进行脑Bax和Bcl-2蛋白免疫组织化学染色。每只小鼠缺血脑组织周边区随机选4个互不重叠、互不干扰的400高倍视野，并由软件分析Bax和Bcl-2阳性细胞百分比（%）。

1.8 RT-qPCR测定脑Bax和Bcl-2 mRNA的基因表达

再灌注24 h后，每组另取8只小鼠，取小鼠缺血侧脑组织进行匀浆，按照试剂盒说明抽提总RNA后，由核酸蛋白检测仪测定RNA浓度和纯度。对RNA进行逆转录获得产物cDNA，之后进行PCR反应，反应条件为：94℃ 预变性 5 min；94℃ 变性 30 s，35℃ 退火35 s，72℃ 延伸1 min，反应40个循环，设内参 βactin进行标化。结果分析以 2-ΔΔCt法计算相应的mRNA表达水平，即以目的基因的Ct值与β-actin的Ct值的差值 ΔCt，计算 2-ΔΔCt=2-（ΔCt实验组-ΔCt对照组），作为相对含量进行分析。基因引物序列表见表1。

表1 基因引物序列表

1.9 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行处理，所有计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DMY对小鼠脑组织缺血周边区细胞凋亡的影响

镜下观察，TUNEL阳性凋亡细胞的胞核呈现出棕褐色。凋亡阳性细胞率测定结果表明，假手术组几乎无 TUNEL 阳性细胞表达[（8.67±2.08）%]。与假手术组比较，I/R模型组TUNEL阳性细胞数量 [（80.33±5.50）%]明显增加（P＜0.01）；而 DMY 组中 TUNEL 阳性细胞数量[（31.00±3.61）%]较 I/R 模型组显著减少（P＜0.01）。结果见图 1、图 2。

图1 小鼠缺血周边区脑组织细胞的凋亡（400×）

图2 DMY对小鼠缺血周边区脑组织细胞凋亡的影响（TUNEL法）（

±s，n=6）

2.2 DMY对小鼠缺血灶脑组织周边区Bax和Bcl-2相关凋亡蛋白表达的影响

小鼠缺血的脑组织，经过血液再灌注后，Bax阳性细胞主要表现为胞浆、胞核均着色。假手术组Bax阳性表达率极低[（8.40±2.07）%]，与之比较，模型组Bax 阳性表达量[（69.80±7.46）%]明显增加（P＜0.01）；而与I/R模型组比较，DMY组能显著降低Bax在脑缺血再灌注区的阳性表达[（42.60±5.32）%]（P＜0.01）。结果见图3、图4。

图3 小鼠缺血脑组织中Bax的蛋白表达（400×）

图4 小鼠缺血脑组织Bax蛋白表达（

±s，n=6）

Bcl-2阳性染色主要位于胞质。假手术组可见大量阳性面积表达[（71.00±6.04）%]，与假手术组比较，模型组 Bcl-2 阳性细胞数量[（30.40±3.51）%]减少（P＜0.01）；与而与I/R模型组比较，DMY能明显增加Bcl-2阳性细胞数量[（46.60±2.07）%]（P＜0.01）。结果见图 5、图 6。

图5 小鼠缺血脑组中Bcl-2蛋白的表达（400×）

图6 小鼠缺血脑组织Bcl-2蛋白表达（

±s，n=6）

2.3 DMY对小鼠缺血脑组织Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响

进行相对表达量计算后可得，与假手术组[（0.97±0.03）倍]比较，I/R 模型组的 Bax mRNA 表达量[（10.81±1.62）倍]明显上调（P＜0.01）；与 I/R 模型组比较，DMY组显著下调 Bax mRNA 表达量[（5.65±0.37）倍]（P＜0.01）。在 I/R 模型组中 Bcl-2 mRNA 表达量[（0.10±0.01）倍]较假手术组[（1.02±0.03）倍]明显降低（P＜0.01）；与 I/R模型组比较，DMY组 Bcl-2 mRNA表达量 [（0.29±0.51）倍]显著增加（P＜0.01）。结果见图 7。

图7 小鼠缺血脑组织中Bax和Bcl-2 mRNA表达（

±s，n=8）

3 讨论

本研究在建立小鼠大脑I/R损伤模型的基础上观察DMY对小鼠局灶性脑缺血再灌注后抗细胞凋亡的保护机制。脑缺血再灌注损伤之后可引起以细胞凋亡为主要机制的炎症损伤[5]。脑缺血后，细胞在形态上表现皱缩，细胞间隙加大并脱离，密度增加引起通透性改变，核质浓缩，核膜核仁发生破裂。脑缺血再灌注后，主要通过缺血细胞中的钙离子沉积、氧化应激、线粒体因素来诱导细胞凋亡的启动[6]。通过TUNEL染色后发现，缺血区出现明显细胞固缩变形，体积变小，核染色质呈现边集化，与相关文献的研究结果一致[7]。脑I/R损伤后，缺血区细胞凋亡数量明显增多，而DMY可以减少缺血区细胞凋亡的数量。研究结果提示DMY可通过抗凋亡作用保护脑I/R损伤。

炎症反应直接参与损伤细胞的同时又可通过线粒体介导的内源性途径[8]、细胞表面的死亡受体如Fas和肿瘤坏死因TNF-R引发的外源性途径[9-10]等诱导细胞凋亡间接导致损伤。在脑血管疾病中，细胞中线粒体功能急性紊乱是首先发生的，也是基本的因素[11]。脑缺血再灌注损伤主要涉及线粒体功能的障碍和衰竭，包括氧化应激、内质网裂解和超微结构损伤，导致细胞主要通过内源性途径发挥凋亡作用，所以内途径通路在缺血再灌注损伤中表现得尤为重要。内途径主要是由Bax和Bcl-2这两个相互为拮抗的蛋白通过调节线粒体膜的通透性来激活胱冬肽酶-3（caspase-3），从而发挥作用[12]。作为体内重要的凋亡调节因子，存活基因Bcl-2的主要作用是抑制细胞凋亡，促凋亡基因Bax则通过作用于线粒体释放其中的凋亡相关分子Apaf-1，使之与Cytc共同激活caspase信号转导途径。Bax和Bcl-2的比例失衡，使促凋亡因子细胞色素C被释放到胞质中，从而和caspase-9形成复合物后，作为细胞凋亡内源性途径的发起者，进一步激活下游caspase-3，并且启动凋亡的过程诱导细胞凋亡[13]。针刺对神经系统疾病的抗细胞凋亡的主要机制是Bcl-2表达上调和Bax和caspase表达下降[14]；三七总皂苷R1激活Bcl-2的表达以及通过抑制Bax蛋白表达的来减少脑梗死面积，减少细胞凋亡[15]；DMY逆转由3-硝基丙酸诱导的大鼠行为缺陷和纹状体组织病理损伤，通过诱导Bcl-2的上调，使细胞凋亡明显减少[16]。Bcl-2是抑制凋亡因子，所以说Bax和Bcl-2的表达影响着细胞凋亡的发生，而这不仅仅是体现在脑血管疾病中，在抗肿瘤中的作用也是如此。左彦珍等[17]发现，DMY可以通过下调Bcl-2/Bax的比值来促进宫颈癌HeLa细胞凋亡而起到抗肿瘤作用；DMY还可以通过保护氧化应激，下调半胱氨酸蛋白酶活化和上调Bcl-2的蛋白表达，诱导骨肉瘤细胞凋亡[18]。综上所述，细胞凋亡主要依赖内源性途径，Bax和Bcl-2作为介导内源性途径的凋亡相关因子扮演着重要角色。

本实验通过免疫组化法测定Bcl-2和Bax的阳性细胞表达，并进一步用荧光定量PCR检测相关mRNA表达。通过实验表明，脑I/R损伤后，I/R模型组Bax蛋白表达和mRNA表达均显著上调，而Bcl-2蛋白和mRNA表达均显著下降，Bax＞Bcl-2，说明脑I/R损伤后脑神经细胞抗凋亡能力下降，表现为促进凋亡。而在DMY组，DMY明显抑制Bax上调，上调Bcl-2蛋白和mRNA表达。由此可知，预先给予DMY能减少脑I/R损伤细胞内损伤后细胞内Bax/Bcl-2病理性调控所引发的凋亡。提示细胞凋亡的早期，线粒体在核染色体DNA还未改变之前就已经出现改变，说明其凋亡过程可能有线粒体来完成[19]。以上结果提示DMY可以通过抑制I/R损伤后的细胞凋亡反应发挥神经保护作用，机制可能语Bax/Bcl-2介导的凋亡途径有关[20]。

综上所述，本实验结果表明DMY可以减轻神经元凋亡，同时下调Bax蛋白及mRNA表达，上调Bcl-2蛋白和mRNA表达，提示DMY对脑I/R损伤的神经保护作用可能归因于对抗细胞凋亡，其机制可能与调节Bax/Bcl-2凋亡途径有关。

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