Article Info

近几年，由于药物和医术的精进使得患者心肺复苏、肺栓塞和心脏转流等都得到了改善，但是仍然有影响因素，其中最重要的就是肺缺血再灌注损伤[1]。阿米洛利是一种交换抑制剂，其主要是交换Na+/H+，国外很多文献中都提到了交换剂在心肌缺血再灌注损伤中的作用，其主要作用就是能够起到抗氧化和抗炎的作用，但在肺缺血再灌注损伤中是否有一定的保护作用目前没有相关实验和文献的印证[2]。本研究对建立肺缺血再灌注大鼠进行模型建造，旨在研究阿米洛利在肺缺血再灌注方面的相关作用。

1 材料与方法

1.1 实验药品与试剂

阿米洛利粉剂购自美国Sigma公司；肝素钠注射液购自上海生物化学试剂有限公司；丙二醛（MDA）试剂盒和髓过氧化物酶（MPO）试剂盒购自南京生物工程研究所；戊巴比妥钠注射液购自上海试剂三厂；凋亡检测试剂盒购自北京生物有限技术公司。

1.2 实验动物与分组

72只健康雄性SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠由华北理工大学实验动物中心提供，体重180～220 g，动物生产合格证号为SCXK冀20061026-0001795。给予充分饲料和饮水1周后进行实验。SD大鼠随机分为三组，每组24只。IR组（缺血再灌注）：先开胸游离右肺门，然后进行夹闭阻隔，之后继续完成灌注。假手术组（C组）：先开胸游离右肺门后，但是对其不进行夹闭阻隔。阿米洛利组（A 组）：使用 5 mg/（kg·d）的阿米洛利连续灌胃，时间为1周，1周之后进行手术，剩余操作和IR组一致，无区别[3]。IR组和C组在相同时间点内注入等量的生理盐水。

1.3 大鼠模型的建立

选择健康的SD大鼠（由华北理工大学实验动物中心提供），腹腔注射3%戊巴比妥钠（50 mg/kg）对其进行麻醉。仰卧位固定，将器官切开后进行插管，然后连接动物呼吸机，帮助大鼠通气，动物呼吸机的设置要求：呼吸频率60次/min，在经胸骨右边第3～5肋之间开胸，游离右肺门，穿入手术线，等待5 min，然后夹闭 45 min，之后建成模型[4]。

1.4 标本采集及检测

缺血45 min及再灌注60 min和120 min后收集全血，3000 r/min离心10 min取上清，采集新鲜右肺组织，-80℃保存备用。

1.4.1 血清MDA含量测定腹主动脉抽血3ml，3000r/min离心10 min，分离血清用硫代巴比妥酸（thiobarbituric aci，TBAd）法对血清中的MDA进行检测。

1.4.2 肺组织MPO测定获取右肺上叶相同部位肺组织1 g，取得之后制备成匀浆，最后把制备好的匀浆进行离心，离心之后取上清液用比色法测MPO。

1.4.3 对肺组织湿/干重比值（W/D）进行测定获取大鼠1 g右肺中叶组织，使用分析天平进行称量，称量得到的质量称为湿质量，然后将其放在70℃电热恒温进行干燥，干燥之后得到的质量称为干质量，其中湿质量和干质量的比例是W/D[5]。

1.4.4 肺组织细胞凋亡指数（AI）的检测获取一小块右肺中叶进行固定，固定液选用10%的甲醛溶液，固定之后将其使用常规石蜡进行包埋，对大鼠右侧肺中叶的凋亡细胞进行定量检测。对细胞进行染色，细胞核染色之后呈现棕黄色，也是阳性细胞，除去细胞核之后，还会有部分细胞质也会着色显示为黄色[6]。一些细胞质由于细胞核DNA碎片漏出导致出现阳性着染。对切片进行观察，观察使用工具是切片光镜。

1.4.5 病理检查获取一定量的组织块，以10%的甲醛溶液进行固定后再进行包埋，切片，HE染色，最后在光镜下观察切片的变化。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（

±s）表示，两组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆MDA和肺AI在不同时点的变化情况

各组不同灌注时间点的MDA和AI值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；各组缺血45 min时的MDA、AI比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。IR组灌注60、120 min时的MDA、AI明显提升，且显著高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 血浆MDA、肺AI、肺组织W/D和MPO活性的变化（

±s）

C组：手术对照组（Control组）；A组：药物干预组（Amiloride组）

2.2 肺组织W/D和MPO活性在不同时点的变化情况

各组内不同灌注时间点上的肺组织W/D和MPO活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；在不同灌注时点，IR组与A组的肺组织W/D和MPO活性显著高于C组，差异有统计学意义（P＜0.05），且IR组的肺组织W/D和MPO活性显著高于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.3 肺组织经病理学验证情况分析

正常对照组的肺组织形态无任何明显变化，然后肺泡腔中会变得壁薄，无充血、水肿等情况。缺血再灌注发生45 min之后，就会出现一些症状，主要是血管出现充血，血管出现充血之后，肺泡之间会产生炎性细胞，炎性细胞增多，细胞的损伤程度也会加重。

3 讨论

肺缺血再灌注损伤的病理原因非常复杂，目前尚不明确，研究显示，氧自由基增多，钙离子量也变多，炎症细胞也增多，这些物质增多之后就会聚集在一起，然后造成细胞凋亡，这些在肺缺血再灌注损伤的发展过程中起着非常关键的作用[7]，因此部分学者认为可以主要在这几个方面进行干预，通过这些干预措施实验对肺缺血再灌注损伤的保护[8]。

器官缺血出现再灌注损伤的重要因素是出现氧自由基，氧自由基可以分解患者体内细胞间质的酶和胶原，使得组织器官受到极大损伤，MDA是氧自由基在攻击其他组织时产生的产物[9]，其含量可以直接决定到体内氧化负电荷的大小，是判断产生氧自由基和组织受到损伤的主要指标，在实验过程中也能观察到。在IR组中，灌注时间越长，LVIDA值越大，提示肺缺血再灌注损伤出现在体内能够破坏氧自由基，使得氧自由基平衡彻底被破坏，增加氧自由基，诱发肺水肿和出血症。注射阿米洛利之后，MDA虽然也增多，但是增加的幅度没有IR组大，其降低效果也比较明显，提示阿米洛利具有很强的抗氧化能力，抑制自由基产生，减少肺缺血再灌注损伤。

肺缺血再灌注损伤情况的出现和继续发展与中性粒细胞的激活和聚集有着非常紧密的联系[10]。出现这种情况之后，经过呼吸作用释放出极多的氧自由基和蛋白水解酶，出现的蛋白水解酶会损伤肺血管组织和肺血管组织周围的器官，使得肺泡中的上皮细胞受到损伤。MPO是一种特异性酶，而且还是一种中性粒细胞，其含量可以用中性粒细胞来测定。实验结果显示，注射阿米洛利之后，MPO量明显降低，提示注射阿米洛利能够有效减弱肺缺血再灌注损伤时中性粒细胞的聚集情况。

文献显示，细胞凋亡情况主要和缺血灌注损伤有关系，当处于肺缺血再灌注损伤情况下，患者体内会快速出现大量的氧自由基和钙离子，这两种物质增加，细胞凋亡情况就会加重[11]。本研究结果显示，在缺血情况出现多于30 min时，IR组与C组比较，差异无统计学意义；随着灌注时间的延长，IR组内AI会快速增长，2 h达到最高值，这一结果和国内相关报道的内容一致。本研究结果还显示，A组也升高，但是和IR组比较，数值还是比较低，提示阿米洛利能够抑制肺缺血再灌注损伤，减轻细胞凋亡情况，减少患者损伤情况。

Na＋/H＋交换体属于一种抑制交换体，也称为NHE（Na＋/H＋exchanger），在缺血灌注中体现出了阳离子的作用，表明在患者处于一种缺血状态时，患者体内的酸中毒情况会逐渐加重，随机NHE也会被激活[12]。但是在血液转运过程中却因为细胞出现酸中毒情况而被抑制发展，当再次灌注之后，患者体内的血流会恢复正常，细胞中毒情况也会得到改善，纠正细胞内酸中毒，而且还能聚集钠离子[13]。这是因为ATP量开始减少，Na泵不能排除钠离子，使得Na＋/Ca2＋交换体从反方向开始转出，转出钠离子的同时还会摄入钙离子，使得钙超量，由此造成了氧自由基增多、出现多种炎症反应和患者体内细胞凋亡情况，从而加重了患者的病症。阿米洛利是一种抑制剂，属于Na＋/H＋交换抑制剂，主要作用是推测患者体内的氧自由基是否得到抑制，患者细胞凋亡情况是否得到改善[14]。

目前评价肺水含量和微血管损伤的治疗是肺组织W/D，本研究主要是对IR组灌入W/D，灌入之后其性能还是非常高，提示阿米洛利对于干预患者体内的病症是非常有作用的；同时，也在检查的切片中观察到患者注射阿米洛利之后肺水肿和体内炎症的变化情况，和IR组比较，患者的症状得到了明显的改善，提示阿米洛利的作用是清除患者体内的氧自由基，从而从根本减少患者体内的中性粒细胞[15]。

综上所述，阿米洛利对肺缺血再灌注损伤有着很强的保护作用，这可能与其抑制作用有关，由此来减少钙离子，继而减少人体内分解出的氧自由基，实现抑制患者体内中性颗粒细胞的浸润和减少人体内细胞的凋亡。

[参考文献]

[1]杜旭升，白洁，李建英，等.阿米洛利对肺缺血再灌注损伤大鼠细胞凋亡的影响[J].陕西医学杂志，2014，43（6）：656-658.

[2]蔡燚，李庆节，林爽，等.阿米洛利与白藜芦醇对肝缺血再灌注损伤的保护作用[J].临床和实验医学杂志，2010，9（8）：561-563.

[3]王峰，王培，卢才义，等.Na＋/H＋交换阻滞剂对离体鼠心缺血后再灌注损伤的保护作用[J].空军总医院学报，1993，9（1）：9-12.

[4]张三妹.阿米洛利对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的实验研究[D].太原：山西医科大学，2008.

[5]杜旭升.阿米洛利对大鼠肺脏缺血再灌注损伤保护作用的研究[D].太原：山西医科大学，2008.

[6]李雪卿.阿米洛利对大鼠全脑缺血/再灌注损伤的影响[D].石家庄：河北医科大学，2008.

[7]杜旭升，赵卉，李建强.阿米洛利对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国药物与临床，2008，8（2）：100-102.

[8]张三妹，李光来.阿米洛利对大鼠脑缺血再灌注损伤后ATP酶的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008，6（2）：186-188.

[9]张三妹，李光来.阿米洛利对大鼠脑缺血再灌注损伤后线粒体 SDH 的影响[J].临床医药实践杂志，2008，4（1）：17-19.

[10]胡若愚，邵宏涛，董国华，等.阿米洛利同系物对老龄大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J].实用医学杂志，2007，6（1）：40-43.

[11]朱万琴，柳松.阿米洛利同系物和心肌缺血预处理对再灌注心肌的影响[J].中国医科大学学报，2002，3（3）：45-46.

[12]王红杰，马青，张达仁，等.Na＋/H＋交换抑制剂对离体鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[J].中华麻醉学杂志，2000，4（4）：36-39.

[13]程岚，姚伟星，夏国瑾.阿米洛利对大鼠缺血-再灌注损伤心肌的保护作用[J].同济医科大学学报，1998，23（5）：403-404.

[14]王峰，卢才义，刘宣力，等.Na＋-H＋交换阻滞剂对离体鼠心缺血后再灌注损伤的保护作用[J].中国病理生理杂志，1993，7（3）：63-66.

[15]莫显刚，王兰，洪伟，等.阿米洛利抑制载脂蛋白A1诱导小鼠巨噬细胞ABCA1的降解[J].中国动脉硬化杂志，2016，24（3）：234-238.