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间歇性低氧是指给机体以反复的中等强度的低氧刺激，增强机体对此种乃至更高程度低氧的耐受力，以避免对机体真正不可逆损伤的产生[1]。有研究显示，低氧适应可以增加心脏对缺氧缺血损伤的保护作用[2]。PI3K及下游靶蛋白所组成的信号途径是目前细胞内重要的信号转导通路之一，具有调节细胞增殖分化凋亡的作用。本实验旨在探讨在间歇性低氧条件下，PI3K、HIF-1α、VEGF2 在心肌缺血/再灌注损伤中的表达及保护机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

本实验经南昌大学医学院动物伦理委员会审查通过，许可证号为SCXK（赣）2009-0001。取10周左右雄性 SD 大鼠 72 只，体重（180±18）g，由南昌大学动物实验中心提供。

1.2 主要仪器与试剂

渥曼青霉素购自Alexis公司，谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）监测试剂盒（武汉亚法生物制品有限公司），小鼠抗Akt单克隆抗体、HIF-1α抗体、VEGF-2抗体购自美国 Santa Cruz公司，兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Sigma公司，蛋白浓度测定标准品购自普利莱公司。

1.3 实验分组及处理

将实验动物分为4组，制作大鼠制作间歇性低氧模型[3]，具体如下。每日在低氧氧舱分别接受4次减压低氧处理，每次低氧循环接受2 min 6%～8%低氧，然后3 min再氧和处理5次，间歇性低氧处理14 d。未进行低氧处理的大鼠作为对照组。制作大鼠缺血/再灌注模型，10%水合氯醛麻醉大鼠，按文献方法制作制作模型治疗[4]。假手术组（n=18）：丝线穿过冠状动脉但左室支但不结扎，通过尾静脉注射生理盐水；I/R组（n=18）：制作大鼠缺血/再灌注模型；IH+I/R组（n=18）：建立间歇性低氧动物模型后，制作缺血/再灌注模型；IH+I/R+PI3K抑制剂组（渥曼青霉素）（n=18）：建立间歇性低氧模型，制作缺血/再灌注模型时，冠状动脉左前降支闭塞15 min前注射磷脂酰肌醇酯3激酶抑制剂-渥曼青霉素（腹腔注射）。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 MDA、GSH、CK-MB含量监测缺血/再灌注2 h后自腹主动脉取血5 ml，静置30 min，离心10 min（4℃，3000 r/min），血清分离，按试剂盒说明测定MDA、GSH、CK-MB 含量。

1.4.2 大鼠左心室收缩期末期容积、舒张末期容积、射血分数测定实验大鼠在外科处理8周后行超声心动图检查。采用异氟烷轻度全身麻醉，选取12 MHz探头，二维心室图从胸骨旁长轴短轴和四个腔室定位获得，通过Modified Simpson Rule测量左心室收缩末期容积（LVESV）及舒张末期容积（LVEDV），计算左心室射血分数，同一观察者采用双盲法测量所有测量值，所有测量结果连续测5次取平均值。

1.4.3 Western blot法检测 Akt、HIF-1α、VEGF2 蛋白表达制模结束后处死手术处理后的存活大鼠，提取碾磨心肌组织，按蛋白提取试剂盒说明书步骤提取总蛋白，BCA法蛋白进行蛋白定量，收集上清液，SDSPAGE分离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，常温下TBST封闭过夜，再加入一抗，沉淀，洗膜，显色。具体方法参照文献，实验胶片扫描后用Image J软件进行图像分析，比值结果表示蛋白的相对含量，用Gel-ProAnalyzer分析软件分析通道蛋白的灰度值。

1.5 统计学分析

采用SPSS 15.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，组间两两比较采用q检验，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各实验组MDA、GSH、CK-MB水平的比较

与假手术组比较，I/R组反映氧化损伤的MDA、CK-MB含量高于假手术组，GSH含量低于假手术组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与I/R组比较，IH+I/R组的CK-MB、MDA含量低于I/R组，GSH含量高于I/R组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与 IH+I/R组比较，IH+I/R+PI3K抑制剂组的CK-MB、MDA含量高于IH+I/R组，GSH含量低于IH+I/R组，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

表1 各实验组MDA、GSH、CK-MB水平的比较（

±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与I/R组比较，△P＜0.05；与IH+I/R组比较，#P＜0.05

2.2 各实验组大鼠左室容积、射血分数的比较

各实验组外科处理后，8周后通过超声心动图测LVEDV、LVESV、LVEF。I/R 组的 LVEDV、LVESV、LVEF与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；IH+I/R组的LVEDV、LVESV、LVEF与I/R组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示间歇性低氧对缺血/再灌注损伤的大鼠心功能有保护作用；IH+I/R+PI3K抑制剂组的LVEDV、LVESV、LVEF与IH+I/R组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），使用PI3K抑制剂组后，间歇性低氧对缺血/再灌注损伤大鼠心功能保护作用下降（表 2）。

表2 各实验组大鼠左室容积、射血分数的比较（n=18，

±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与I/R组比较，△P＜0.05；与IH+I/R组比较，#P＜0.05

2.3 各实验组心肌组织 Akt、HIF-1α、VEGF-2 蛋白表达

通过Western blot法检测各实验组的Akt、HIF-1α、VEGF-2 蛋白水平，结果显示，I/R 组的 Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表达低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；IH+I/R 组的 Akt、HIF-1α、VEGF-2 蛋白表达高于I/R组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示间歇性低氧促进了 Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表达增加；IH+I/R+PI3K 抑制剂组的 Akt、HIF-1α、VEGF2 蛋白表达低于IH+I/R组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示在间歇性低氧状态下，PI3K抑制剂组不仅对Akt表达有关，而且HIF-1α、VEGF-2表达与PI3K信号通路激活有明显关系（表3、图1）。3讨论

表3 各实验组 Akt、 HIF-1α、VEGF-2 蛋白表达的比较（n=18，

±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与I/R组比较，△P＜0.05；与IH+I/R组比较，#P＜0.05

图1 各实验组Akt、HIF-1α、VEGF-2蛋白表达

间歇性低氧适应可减轻应激、缺血/再灌注及心律失常等心肌损伤，长期适应高原低氧能增加心脏对缺血损伤的适应能力[5-6]。但是目前关于间歇性低氧具体心肌保护作用机制的研究还是非常匮乏。

磷脂酰肌醇-3激酶是细胞内信号传导有关的脂类第二信使，可通过信号转导、改善心肌收缩力及间接调节钙通道钙离子内流等方面调节心肌功能[7-8]，在缺血/再灌注损伤中有重要作用。

本实验建立间歇性低氧模型，发现间歇性低氧预处理后，Akt蛋白表达高于I/R组，MDA、CK-MB含量低于I/R组，GSH含量高于I/R组，左心功能改善；而使用PI3K抑制剂组后，Akt蛋白表达低于IH+I/R组，MDA、CK-MB含量高于IH+I/R组，GSH含量低于IH+I/R组，LVEF低于IH+I/R组。实验结果提示间歇性低氧可以激活PI3K-Akt信号途径，增加AKt蛋白表达，减少细胞氧化损伤及减轻心肌缺血/再灌注损伤。

实验同时检测了低氧诱导因子HIF-1α及其下游因子VEGF-2在间歇性低氧处理后的表达，HIF-1α位于细胞质中，但在低氧条件下，HIF-1α稳定性和转录活性可显著增加，在缺血组织中介导促血管生成的作用[9-11]。血管内皮生长因子促进内皮细胞分裂、增殖、迁移、趋化，形成新血管。血管内皮生长因子VEGF-2在组织缺氧时能刺激血管新生[12-14]，而且还具有抑制凋亡蛋白表达上调，促进血管新生，维持内皮细胞存活的功能[15-17]。

本实验结果显示，间歇性低氧处理后，PI3K-Akt信号通路激活，心肌缺血/再灌注损伤减轻，HIF-1α表达增加，下游因子VEGF-2增加，间歇性低氧心肌保护作用与间歇性低氧状态AKt活化减少细胞氧化损伤减少细胞凋亡有关，同时也与低氧诱导因子及血管内皮生长因子促进新生血管有关，而使用PI3K抑制剂后，AKT表达下降的同时，HIF-1α及下游因子VEGF-2表达也同时下降，提示低氧诱导因子及血管内皮生长因子的表达中需要激活PI3K-Akt信号途径，需要AKt蛋白高表达，同时提示PI3K/AKT通路除了减轻氧化损伤调节细胞增殖凋亡外，还在新生血管的形成中发挥着重要作用。除此之外，PI3K/AKT信号通路还可能通过抑制促凋亡蛋白、调节钙离子在心肌细胞胞质中的浓度，促进心肌细胞能量的代谢以及抑制炎症反应的进行等过程完成多种机制发挥心肌保护作用[18-20]，其内在机制值得进一步研究探讨。

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