吴雄健1郑 虹2朱海燕1毛忠懿1谢 军1

1.赣南医学院第一附属医院消化内科，江西赣州 341000；2.赣南医学院，江西赣州 341000

[摘要]目的探讨姜黄素对大鼠肝纤维化防治作用的机制，为临床治疗提供参考。方法建立CCl4致大鼠实验性肝纤维化的模型，同时每只大鼠按每100克体重分别给予20、10、5 mg姜黄素进行灌胃处理，相应设定为模型给药组、模型组以及对照组，每组各10只大鼠。比色法检测血清组织内活性氧类物质（ROS）水平；丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法）检测肝组织MDA含量；凝胶迁移实验（EMSA）检测肝组织NF-κB活性；免疫组织化学法检测肝组织中NF-κB表达、转化生长因子-β超家族（TGF-β1）、血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）、重组人结缔组织生长因子（CTGF）水平；RT-PCR法检测肝组织基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的mRNA水平。并对各组检测结果进行统计分析。结果模型组大鼠的 ROS、内毒素、MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA 水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；模型给药组大鼠的上述因子水平均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论姜黄素对血清中 ROS 及内毒素水平，肝组织中 MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA表达均有不同程度的抑制作用，其通过多种机制参与到预防肝纤维化的过程中。

肝纤维化是由多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，表现为肝内细胞外间质成分过度、异常地沉积，并影响肝脏的功能，是慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段。肝纤维化的形成和发生机制极为复杂，由于对这种复杂的发病机制尚未认识清楚，故肝纤维化的临床治疗一直未取得突破性进展[1]。近年来，中医药在治疗肝纤维化方面显示了广阔的前景，由于中药具有多层次、多靶点的综合药理作用，对肝纤维化复杂的发病机制有一定的针对性，已受到广泛重视。姜黄素是从中药姜黄根茎中提取的一种酚性色素，具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等，尤其是可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，引起人们的研究兴趣[2]。肝星状细胞增殖与凋亡的失平衡是肝纤维化发生的细胞生物学基础，活化肝星状细胞产生大量的细胞外间质，抑制其降解，使细胞外间质大量沉积，肝纤维化发生。抑制其活化和诱导凋亡是治疗肝纤维化的重要策略，通过肝星状细胞凋亡，去除了细胞外间质的来源，促进了细胞外间质的降解，肝纤维化得以恢复[3-5]。本研究在原有工作基础上设想，姜黄素也可能通过诱导肝星状细胞凋亡，进而在肝纤维化的治疗中发挥作用，并进行实验研究，以期明确姜黄素抗肝纤维化的作用机制，为肝纤维化的防治提供新的途径，现报道如下。

雄性成年SD大鼠30只，合格证号：SCXK（渝）2010-2012，180～200 g。姜黄素购自Sigma公司，检测试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。

建立CCl4致大鼠实验性肝纤维化的模型，同时每只大鼠按每100克体重分别给予20、10、5 mg姜黄素进行灌胃处理，相应设定为模型给药组、模型组以及对照组，每组各10只大鼠。用二氯亚甲基二磷酸盐处理SD大鼠后，以原位胶原酶灌注结合密度梯度离心法分离大鼠肝星状细胞，并计算细胞得率和细胞活力，进行细胞的鉴定和培养。

肝星状细胞与姜黄素孵育后，以MTT比色法检测姜黄素对肝星状细胞增殖的影响，用流式细胞术分析姜黄素对肝星状细胞细胞周期的影响，并用流式细胞术、透射电镜和琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。

比色法检测血清ROS水平；TBA法检测肝组织MDA含量；EMSA检测肝组织NF-κB活性；免疫组织化学法检测肝组织中 NF-κB 表达、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平；RT-PCR法检测肝组织TIMP-1的mRNA水平。并对各组检测结果进行统计分析。

MTT比色法操作流程：①收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μl，铺板使待测细胞调密度至1000～10000孔（边缘孔用无菌PBS填充）。②5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物，原则上细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5～7个梯度，每孔100 μl，设3～5个复孔，建议设5个，否则难以反应真实情况。③5%CO2，37℃孵育16～48 h，倒置显微镜下观察。④每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4 h。 若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2～3遍后，再加入含MTT的培养液。⑤终止培养，小心吸去孔内培养液。⑥每孔加入150 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。⑦同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。

RT-PCR法操作流程：从细胞或特定组织中提取总RNA；逆转录实验；扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。检验操作所需试剂盒均购自上海居里生物科技有限公司。

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

模型组大鼠的 ROS、MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGFBB、CTGF、TIMP-1mRNA水平均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。模型给药组的上述因子水平均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

肝星状细胞在肝纤维化的发生、发展中，发挥了十分重要的作用，研究证实，肝星状细胞的增殖与凋亡失衡，为肝纤维化发生的细胞生物学基础，肝纤维化治疗的策略主要是抑制活化、诱导凋亡[6-7]。肝星状细胞参与了肝纤维化的启动，此时肝星状细胞会转化成肌成纤维细胞，合成大量ECM，在肝脏内，ECM会大量沉积，最终诱发肝纤维化的形成[8]。肝星状细胞活化后，会促进纤维化的生成，被活化的肝星状细胞能够阻止ECM发生降解，对肝脏免疫功能也会产生一定程度的影响。有研究结果提示，在肝损伤后，肝星状细胞被激活，大量增殖，同时产生细胞外基质，利用其收缩功能，参与了门静脉高压的形成，最终诱发肝纤维化[9]。因肝星状细胞在肝纤维化发病机制中所扮演的重要角色，使得其受到学者们的高度重视，近几年，诱导肝星状细胞凋亡在肝纤维化治疗研究中，已经成为热点和重点[10]。通过诱导肝星状细胞凋亡，能够使胶原合成来源减少，有效促进细胞外基质降解，这对于肝纤维化的恢复十分有利[11]。

姜黄素是中药姜黄中所提取出的酚类色素，主要药理作用是抗氧化、抗炎、降血脂、降血压、保护肝功能等[12-14]。有研究发现，姜黄素对CCl4诱导大鼠肝纤维化可产生明显治疗效果[15]。曾有文献报道，姜黄素不但能够对肝星状细胞增殖进行抑制，并诱导死亡，体内外实验中还发现，姜黄素能够对肝星状细胞由静止表型向活化表型转化进行有效抑制，有效降低活化标志物α-SMA表达水平，体外肝星状细胞合成Ⅰ型胶原降低，肝内胶原沉积减少，由此可知，姜黄素在体内外均能够对肝星状细胞的合成进行抑制[16-18]。现阶段，肝纤维化的治疗尚无特效药物，目前临床上应用的抗肝纤维化药物中，或作用不强，或毒性太大，因此临床应用受到明显限制。姜黄素在应用过程中，并未发生明显不良反应，经人体实验证实，即便是剂量为8 g/d，持续用药3个月，也未见患者出现不良反应。由此可见，姜黄素在抗肝纤维化治疗中，安全有效。

本研究中，以对姜黄素对大鼠肝纤维化防治作用的机制进行分析探讨为目的，建立了CCl4诱导肝纤维化的大鼠模型，并展开了分组实验，对比观察了模型组、模型加姜黄素组与正常对照组大鼠的ROS、MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA 水平，结果提示，模型组大鼠的 ROS、内毒素、MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA 水平均高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）。给予姜黄素干预后的模型给药组的上述因子水平均不同程度低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。这一结果与相关文献[19-21]报道结果类似，由此证实，姜黄素对血清中ROS及内毒素水平， 肝组织中 MDA、NF-κB、TGF-β1、PDGF-BB、CTGF、TIMP-1mRNA表达均有不同程度的抑制作用，其通过多种机制参与到预防肝纤维化的过程中。

综上所述，本研究在动物实验水平观察姜黄素抑制肝内HSC内NF-κB的激活，降低肝组织中TIMP-1的mRNA的表达水平，减少肝组织中TGF-β1、PDGF、CTGF的表达，进而抑制HSC的活化，达到预防肝纤维化的作用，这对于日后研究与实践均具有重要指导性意义，值得关注。

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Study of Curcumin on hepatic stellate cells in rats

WU Xiong-jian1ZHENG Hong2ZHU Hai-yan1MAO Zhong-yi1XIE Jun1
1.Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College,Ganzhou 341000,China;2.Gannan Medical College,Jiangxi Province,Ganzhou 341000,China

[Abstract]ObjectiveTo explore the mechanism of Curcumin on the prevention and treatment of liver fibrosis in rats,so as to provide reference for clinical treatment.MethodsThe rat model of experimental liver fibrosis induced by CCl4was established.At the same time,20 mg,10 mg and 5 mg Curcumin were in lavage in every 100 g body weight,the corresponding models were set as delivery model group,model group and control group respectively,10 rats in each group.The level of reactive oxygen species(ROS)in serum was detected by colorimetric method.Malondialdehyde(MDA)content in liver tissue was detected by MDA assay kit(TBA method).By electrophoretic mobility shift assay(EMSA),the activity of NF-κB in liver tissue was detected.The levels of NF-κB expression,TGF-β1,platelet-derived growth factor-BB(PDGF-BB)and recombinant human connective tissue growth factor(CTGF)in liver tissue were detected by immunohistochemistry.The mRNA level of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in liver tissue was detected by RT-PCR.The results after detection were statistically analyzed.ResultsIn the model group,the levels of ROS,endotoxin,MDA,NF-κB,TGF-β1,PDGF-BB,CTGF and TIMP-1mRNA were significantly higher than those in the normal group,and the differences were statistically significant(P<0.05).The levels of above-mentioned factors in the delivery model group were all lower than those in the model group,and the differences were statistically significant(P<0.05).ConclusionCurcumin presents with the inhibition of ROS and endotoxin levels in serum,MDA,NF-κB,TGF-β1,PDGF-BB,CTGF,and TIMP-1 mRNA expression in liver tissue to some extent and participants in the liver fibrosis prevention through a variety of mechanisms.

（收稿日期：2017-08-21 本文编辑：孟庆卿）