刘文俊1高宇婷2窦智2于凯洋2刘凤智2年宇婷2单德红3▲

1.辽宁中医药大学教学实验中心，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学第一临床学院，辽宁 沈阳 110847；3.辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 110847

[摘要]目的探讨旷场实验评价脾气虚和脾阳虚大鼠“神疲”的可能性及初步机制。方法选取24只雄性SPF级SD大鼠作为研究对象，随机分为对照组、脾气虚组和脾阳虚组，每组8只；采用旷场实验检测各组大鼠的运动距离和站立次数；采用电镜观察各组的海马神经元线粒体形态学变化；采用比色法检测各组海马组织的ATP水平。结果脾气虚组和脾阳虚组在旷场实验中的运动距离短于对照组，站立次数少于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；脾阳虚组在旷场实验中的运动距离短于脾气虚组，站立次数少于脾气虚组，差异有统计学意义（P<0.01）；脾气虚组和脾阳虚组大鼠的海马神经元线粒体均出现肿胀、空泡化，ATP水平均低于对照组（P<0.01）；脾阳虚组的ATP水平低于脾气虚组（P<0.01）。结论旷场实验能够较客观地评价和区分脾气虚和脾阳虚大鼠的“神疲”，其生物学基础与海马神经元线粒体损伤有关。

[关键词]神疲；脾气虚；脾阳虚；旷场实验；线粒体

“神疲”是评价脾气虚和脾阳虚大鼠模型的重要宏观表征[1-5]，但其评价方法多为目测，客观量化不足，不仅影响了模型复制的稳定性和可靠性，还难以区分“神疲”的程度。旷场实验（open field test，OFT）是检测啮齿类动物在新环境中自发活动和探索行为的经典实验，主要用于分析动物的认知能力、紧张度、兴趣度，在一定程度上反映了中枢神经系统（central nervous system，CNS）的兴奋程度[6-8]。本研究尝试将OFT用于客观评价脾气虚、脾阳虚模型大鼠的“神疲”，并从海马线粒体方面揭示其可能依据。

选取24只SPF级健康雄性SD大鼠，体质量（200±10）g，购于本溪实验动物中心[许可证号：SCXK（辽）-2010-0001]，随机分为对照组、脾气虚组和脾阳虚组，每组8只。适应性饲养1周，自由饮水进食，（20±2）℃，相对湿度45%～55%。

脾气虚证模型复制方法参考文献[9-10]：脾气虚组大鼠施加饮食不节加力竭游泳刺激，即先饱食1 d，再禁食2 d，自由饮水；每日游泳至力竭，水温35～37℃，连续15 d。脾阳虚证模型复制方法：取脾气虚模型大鼠每日灌服20%番泻叶水浸剂（2 ml/100 g），早晚各1次，连续7 d。

脾气虚证的评价标准如下。①消瘦：体质量明显下降；②食少：代谢笼计量24 h单只进食量和饮水量，均明显减少为达标；③乏力：双前肢抓力明显变小，检测方法见文献[10]；④被毛枯槁无华：三人分别观察且一致认定。脾阳虚证的评价标准如下。前述标准加①畏寒：9～10时测大鼠肛温，明显下降为达标；②便稀：粪便含水率明显升高。

采用成都泰盟TM-Vision行为学实验系统进行检测。将大鼠放入箱体中心，主要观察5 min内大鼠的运动距离、站立次数等。彻底清洁箱体后，检测下1只大鼠。

大鼠腹腔注射20%乌拉坦（0.4 ml/100 g）麻醉后，在4℃下将海马切成约1 mm3小块，2.5%戊二醛固定，PBS漂洗后1%锇酸固定，乙醇、丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋聚合，LKB-1型超薄切片机切片（50～60 nm厚），3%醋酸铀-枸橼酸铅双染，日本电子JEM-1011透射电镜观察并拍片。

采用比色法，试剂盒购自南京建成生物技术有限公司（A095）。应用Bio-Rad美国伯乐iMark酶标仪，严格按照说明书操作。

采用SPSS 17.0软件分析数据，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义[11]。

对照组大鼠体格健壮，反应灵敏，被毛紧密有光泽；脾气虚组大鼠消瘦，反应迟钝，被毛蓬起枯槁无光泽；脾阳虚组大鼠消瘦，反应迟钝，被毛枯槁无光泽，肛周污秽，垫料潮湿。由表1可见，脾气虚组前4项均明显低于对照组（P<0.05），说明该组大鼠出现消瘦、食少和乏力；脾阳虚组除大便含水率显著升高（P<0.01）外，其余指标均显著低于对照组（P<0.01），表明该组大鼠出现消瘦、食少、乏力、畏寒和便稀。以上结果表明二证大鼠模型复制成功。

由图1和表2可见，对照组大鼠的活动区域以角落和四周为主，脾气虚组大鼠在中心活动增多，但其运动距离和站立次数均显著低于对照组（P<0.05）；而脾阳虚组活动范围最小，甚至没有形成闭合运动轨迹，其运动距离和站立次数均显著低于对照组和脾气虚组（P<0.05），表2亦显示了后两组和对照组的相对值。

由图2可见，对照组大鼠海马神经元内线粒体形态基本正常，数量较多，而脾气虚和脾阳虚组线粒体均出现肿胀、空泡化，数量较少。三组大鼠海马组织ATP水平分别是（1.32±0.60）、（0.81±0.38）和（0.28±0.13）pmol/mg，后两组显著低于对照组（P<0.05），且脾阳虚组显著低于脾气虚组（P<0.01）。

正常动物进入旷场后，因畏惧开阔、未知和存在潜在危险的环境而“贴墙”活动，适应后再进行探索，尝试通过中心区域，并不时站立[12-13]。因为OFT能够较好地反映CNS的兴奋程度，所以本实验将其用于评价大鼠的“神疲”。本实验结果显示，对照组大鼠活动范围大，运动距离远，站立次数多，反映其CNS较为兴奋；脾气虚组大鼠的活动区域虽然也较大，但其运动距离和站立次数均显著低于对照组，提示其CNS兴奋度较低，出现了“神疲”状态；而脾阳虚组大鼠的活动范围明显变小，且运动距离和站立次数不仅低于对照组，也低于脾气虚组，表明该组大鼠的CNS兴奋性明显下降。

由于神疲与脾虚所致气血亏虚、神失所养有关，而脾阳虚多源于脾气虚，故脾阳虚之神疲要甚于脾气虚之神疲，但临证对此并不详查，盖因区分此二证主要看是否有寒象。不过对于实验研究，特别涉及神经科学，还是有必要量化区分。本实验观察到，后两组的运动距离分别为对照组的51.83%、8.79%，站立次数分别是对照组的73.94%、24.24%，表明脾阳虚之“神疲”要甚于脾气虚之“神疲”，这与中医理论一致。由此可以认为，OFT可以用来较为客观地评价和区分脾气虚和脾阳虚的“神疲”。

由于大鼠行为学表现与海马关系密切，本文进一步从海马线粒体方面探讨“神疲”的发生原因[14-17]。结果显示，后两组大鼠海马神经元的线粒体均出现结构损伤和数量减少，且ATP水平明显下降，提示在脾气虚和脾阳虚时海马能量不足，这种可能是气血不足、神失所养的一个表现。而脾阳虚组海马线粒体损伤和ATP水平下降要甚于脾气虚组，则可能是该组大鼠“神疲”程度重于脾气虚组的原因之一[18-19]，因此，海马线粒体损伤可能是OFT能够较好地评价脾气虚和脾阳虚大鼠“神疲”的生物学基础。

综上所述，本实验认为旷场实验能够较好地评价和区分脾气虚和脾阳虚大鼠的“神疲”，其生物学基础与海马神经元线粒体损伤有关。

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Exploration of open field test evaluating the mental fatigue of rats with spleen qi and spleen yang deficiency

LIU Wen-jun1GAO Yu-ting2DOU Zhi2YU Kai-yang2LIU Feng-zhi2NIAN Yu-ting2SHAN De-hong3▲
1.The Teaching Laboratory Center,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine in Liaoning Province,Shenyang 110847,China;2.The First Clinical College,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine in Liaoning Province,Shenyang110847,China;3.Faculty of Basic Medicine,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine in Liaoning Province,Shenyang110847,China

[Abstract]ObjectiveTo explore the possibility and the preliminary mechanism of open field test evaluating the mental fatigue of rats with spleen qi deficiency(SQD)and spleen yang deficiency(SYD).Methods24 SPF male SD rats were selected as objects and they randomly divided into control group,SQD and SYD group,each group had 8 rats.The OFT method was used to detect the motion distance and vertical times.Electron microscope was used to observe the mitochondrial morphology of hippocampal neurons.ATP level in hippocampal tissues of each group were measured by colorimetry.ResultsMotion distance in open field test of SQD and SYD group was shorter than that of control group,and vertical times in SQD and SYD group was fewer than that of control group,and there was a statistical difference(P<0.05).Motion distance in open field test of SYD group was shorter than that of SQD group,and vertical times in SYD group was fewer than that of SQD group,and and there was a statistical difference(P<0.01).Hippocampus neuron mitochondria in SQD and SYD group showed swelling and vacuolization,and ATP level in SQD and SYD group were significantly lesser than that in control group(P<0.01),and ATP level in SYD group was lower than that in SQD group(P<0.01).ConclusionOFT can be used to evaluate and rank the mental fatigue of rats of SQD,SYD objectively and its biological bases might related to the damage of hippocampus neuron mitochondria.

[Key words]Mental fatigue;Spleen qi deficiency;Spleen yang deficiency;Open field test;Mitochondrion

[中图分类号]R332

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）07（c）-0004-04

(收稿日期：2017-05-22本文编辑：许俊琴）

[基金项目]国家重点基础研究发展计划课题（2013CB531702）

[作者简介]刘文俊(1990-），男，硕士，助理实验师，主要从事脾胃生理机制研究

▲通讯作者：单德红，男，教授，硕士研究生导师