陈 欢1刘燕玲1刘学睿1蔡思宇1王佳敏1刘 岚2▲

1.西南医科大学基础医学院，四川泸州 646000；2.西南医科大学医学细胞生物学与遗传学教研室，四川泸州 646000

[摘要：目的探讨大鼠早期酒精性肝损伤模型的建立方法，为研究早期酒精性肝损伤的发病分子机制提供理想动物模型。方法24只雄性SD大鼠随机分为模型组（16只）和对照组（8只）。对照组饮用自来水；模型组饮用7%～56%梯度递增的白酒12周。取材前24 h和12 h，分别以56%白酒急性灌胃后处死大鼠。每天记录大鼠食用饲料量及饮用量；每周称量大鼠体重。采用全自动生化分析仪测定大鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）含量。观察大鼠肝脏病理学和形态学改变。结果12周后，模型组大鼠体重增长率为（61.67±1.98）% ，明显低于对照组的（160.09±3.12）% （P＜0.05），肝脏指数模型组（3.74±0.54）高于对照组（2.85±1.26）（P ＜0.05）。模型组大鼠 ALT、AST、TG、TC 均较对照组增高（P＜0.05），病理学检查模型组肝组织明显脂肪变性，伴局部炎症、坏死。结论该模型操作简便，动物死亡率低，稳定，发病过程与临床类似，是研究早期酒精性肝损伤发病分子机制的理想模型。

[关键词]酒精性肝病；大鼠；肝病模型；肝功能

酒精滥用与依赖日益严重已成为世界性公共卫生问题。长期大量饮酒易导致酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD），早期表现为脂肪肝，可发展为酒精性肝炎、肝纤维化及肝硬化；严重酗酒可造成广泛肝细胞坏死甚至肝衰竭[1-3]。选择与人类ALD相似的动物模型对研究其发病机制具有重要意义。本实验建立酒精浓度梯度递增的白酒长期喂养基础上高浓度酒精急性灌胃诱导的大鼠肝损伤模型，旨在为ALD建立有价值的研究工具。

1.1 材料

SD雄性大鼠（清洁级）24只[西南医科大学动物实验中心提供，SCXK（川）2013-17]，平均体重（200±15）g，饲养条件：温度20～25℃，相对湿度40%～70%。

1.2 主要试剂

56度的北京红星二锅头白酒；HE染色剂：珠海贝索技术有限公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）试剂盒：南京建成生物有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及处理

24只雄性SD大鼠随机分为实验组16只，对照组8只，均标准饲料喂养。对照组饮自来水，模型组饮浓度梯度递增的白酒12周，每周浓度：7%、14%、18%、22%、26%、30%、34%、45%、56%、56%、56%、56%。

1.3.2 观察记录大鼠精神状态、毛发颜色、饮食量、体重变化、死亡情况

1.3.3 肝组织标本采集与处理

12周末，处死大鼠前24 h和12 h，模型组大鼠给予56度的北京红星二锅头白酒（15 g/kg）灌胃2次，对照组等量生理盐水灌胃。禁食6 h后，20%乌拉坦（5 ml/kg）麻醉，剖开腹腔，观察肝脏大小和外观。10%甲醛灌注固定30 min，分离肝脏，称取重量；肝门处切取约10 mm×10 mm的组织，10%甲醛固定。

1.3.4 大鼠体重增长率及肝脏指数

称取大鼠体重，体重增长率（%）=（终重量-初始重量）/初始重量×100%。分离肝脏，称取肝脏湿重，肝脏指数=（肝脏湿重/大鼠体重）×100%。

1.3.5 血清学指标检测

麻醉大鼠后右心房取血，静置30 min离心。按说明书采用全自动生化分析仪检测ALT、AST、TG和TC含量。

1.3.6 肝脏病理变化及肝细胞形态学变化

肝组织固定后脱水、包埋。常规方法制片，HE染色观察大鼠肝脏病理学改变，判定肝脂肪变程度（F0～F4）、炎症程度（G0～G4）和纤维化分级（S0～S4），根据酒精性肝病诊疗指南[4]分级标准（如下）统计分析。

1.3.6.1 酒精性脂肪肝 依据肝细胞脂肪变性占所获取肝组织标本量的范围分为4度（F0～F4），肝细胞脂肪变 F0：＜5%：F1：≥5%～32%；F2：＞32%～65%；F3：＞65%～75%；F4＞75%。

1.3.6.2 酒精性肝炎 依据炎症程度分为4级（G0～G4）：G0无炎症；G1腺泡3带呈现少数气球样肝细胞，腺泡内散在个别点灶状坏死和中央静脉周围炎；G2腺泡3带明显气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死增多，出现Mallory小体，门管区轻至中度炎症；G3腺泡3带广泛的气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死明显，出现Mallory小体和凋亡小体，门管区中度炎症伴和（或）门管区周围炎症；G4融合性坏死和（或）桥接坏死。

1.3.6.3 酒精性肝纤维化 依据纤维化的范围和形态分为 4 期（S0～S4）：S0无纤维化；S1腺泡 3 带局灶性或广泛的窦周/细胞周纤维化和中央静脉周围纤维化；S2纤维化扩展到门管区，中央静脉周围硬化性玻璃样坏死，局灶性或广泛的门管区星芒状纤维化；S3腺泡内广泛纤维化，局灶性或广泛的桥接纤维化；S4肝硬化。

1.4 统计学方法

采用SPSS 14.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；等级资料比较采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 一般情况

各组大鼠均无死亡。对照组大鼠活泼，毛发光泽，食量正常。模型组食欲减退，毛色发黄，光泽度差，部分大鼠精神状态较差。模型组饮用液体量和食量均比对照组少。

2.2 两组大鼠体重增长率及肝脏指数的比较

模型组与对照组体重均有上升，与对照组比较，模型组体重增长较慢，后期有降低趋势。12周后，对照组体重增长率明显高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组肝脏指数高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 两组大鼠体重增长率及肝脏指数的比较（±s）

2.3 两组大鼠血清学指标的比较

模型组大鼠血清ALT、AST、TG、TC含量均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 两组大鼠各项血清学指标的比较（±s）

2.4 肝脏病理变化及肝细胞形态学变化

对照组肝脏棕红色，表面光滑，边缘锐利，质地柔软；模型组肝脏色泽较暗，黄褐色，外观肿大，边缘圆钝。HE染色显示：对照组肝被膜完整，肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐、紧密，胞质丰富，仅有少量脂滴，无明显变性、坏死及炎症细胞浸润（图1-A）。模型组肝小叶中央区受累明显，中央静脉扩张，肝窦扩张，周围大量肝细胞水样变性，脂肪变性明显；有小灶性肝细胞坏死，未见片状坏死；可见炎细胞浸润，纤维病变不明显（图1-B）。按分级标准计分后统计分析可见，模型组动物肝细胞脂肪变性和炎性病变程度与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组肝细胞纤维性变程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表3～5）。

 

图1 大鼠肝脏HE染色病理图（×200）

A.对照组；B.模型组

表3 两组大鼠肝脏脂肪变性分级及比较

 

模型组与对照组比较，P＜0.05

表4 两组大鼠肝脏炎症分级及比较

 

模型组与对照组比较，P＜0.05

表5 两组大鼠肝脏纤维化变性分级及比较

酒精滥用与依赖现象日渐严重，ALD发病率呈逐年上升趋势。10%～20%的长期大量饮酒者可发生程度不等的ALD，危害身体健康[5]。ALD模型建立与动物种属、造模方法、条件、时间及实验目的等多因素密切相关[6]。建立可重复、简单易行、稳定，且与临床相似的动物模型对ALD的研究至关重要。

急性酒精灌胃、慢性酒精喂养、胃内喂养等是国内常用的ALD造模方法，其中急性酒精灌胃法较常用[7-10]，但各实验室在酒精浓度、剂量、灌胃次数等方面无统一标准，且直接灌胃动物死亡率高，模型不稳定。本实验参照Maricic等[11-12]的方法进行了改良，建立了以酒精浓度梯度递增白酒长期喂养基础上高浓度酒精急性灌胃诱导的大鼠ALD模型。该方法与临床酒精性肝损伤患者发病过程相似，有良好模仿性，简单易行。

通过对大鼠一般情况、体重增长率、肝脏指数等指标的观测，实验组与对照组差异有统计学意义。肝脏是酒精代谢的主要场所，长期过量饮酒可导致肝细胞变性，膜通透性增强，细胞内容物释放入血，血清酶学改变。ALT、AST是反映肝细胞损伤最敏感的指标[13-14]，其中ALT诊断价值最高[15]，仅1%的肝细胞坏死即可致血清ALT水平升高1倍。当AST值超过ALT时，提示肝实质损害严重，为慢性加重标志之一[16]。本实验模型组血清ALT、AST均显著高于对照组，说明该造模方式可有效损伤动物肝脏细胞，损坏肝功能。研究发现，酒精可通过产生自由基及脂质过氧化作用造成肝细胞化学性损伤[17-18]。酒精进入机体后，在乙醇脱氢酶和微粒体乙醇氧化酶作用下脱氢氧化为乙酸，使肝细胞内还原型辅酶Ⅰ/辅酶Ⅰ（NADH/NAD）比值升高，抑制三羧酸循环，氧化脂肪酸能力下降，TG合成增加，肝细胞脂肪沉积导致细胞脂肪变性[19]。肝脏中蓄积的TG以极低密度脂蛋白（VLDL）形式出肝入血，血清TG含量相应增加，是反映肝损伤的指标之一[20]。本研究发现，实验动物血清模型组TG、TC均明显高于对照组，证明该模型成功复制ALD特征。

长期酒精慢性刺激基础上急性损伤后，模型组大鼠肝脏形态学和病理学检测均见明显异常。根据2010年中华医学会肝病学分会公布的 《酒精性肝病诊疗指南（2010年修订版）》的组织病理学诊断标准，分级后统计学分析表明模型组动物肝细胞出现明显脂肪变性和炎性病变，与对照组比较，两项指标差异均有统计学意义（P＜0.05）。而两组肝细胞纤维性变程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），可能与该种造模方式酒精刺激较缓和，时间较短有关。

综上所述，本实验成功获得与人类饮酒习惯及临床发病特征类似的ALD早期动物模型。该模型稳定，操作简便且动物死亡率低，为后续实验靶向早期酒精性肝病的分子机制研究和临床防治提供较好模型。

[1]Gao B，Bataller R.Alcoholic liver disease：pathogenesis and new therapeutic targets[J].Gastroenterology，2011，141（5）：1572-1585.

[2]Bruha R，Dvorak K，Petrtyl J.Alcoholic liver disease[J].World J Hepatol，2012，4（3）：81-90.

[3]周恒，李俊，王华.酒精性肝病动物模型研究进展[J].中国药理学通报，2016，32（4）：468-472.

[4]中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.酒精性肝病诊疗指南（2010年修订版）[J].中华肝脏病杂志，2010，18（3）：167-170.

[5]Wang FS，Fan JG，Zhang Z，et al.The global burden of liver disease：the major impact of China[J].Hepatology，2014，60（6）：2099-2108.

[6]王玲，孙妩弋，魏伟，等.酒精性肝病动物模型的研究进展[J].安徽医药，2010，14（7）：745-748.

[7]郭俊英，刘光亮，李月芬，等.酒精诱发大鼠肝损伤的分子机制与蛋白质组学研究[J].现代医药卫生，2012，28（1）：14-17.

[8]李鑫，王晨，聂娇，等.酒精性肝炎小鼠肝肠组织变化与内毒素血症的关系探讨[J].实用肝脏病杂志，2013，16（3）：254-256.

[9]孙希良，吕冠华，杨杰，等.益肝颗粒对酒精性肝损伤大鼠保护作用的实验研究[J].中国中西医结合消化杂志，2014，22（1）：10-12.

[10]汤小刚，洪汝涛.水提乌药与醇提乌药对急性酒精性肝损伤模型大鼠的保护作用[J].中国临床药理学杂志，2016，32（8）：703-706.

[11]Maricic I，Sheng H，Marrero I，et al.Inhibition of type Ⅰnatural killer T cells by retinoids or following sulfatidemediated activation of typeⅡnatural killer T cells attenuates alcoholic liver disease in mice[J].Hepatology，2015，61（4）：1357-1369.

[12]Cui K，Yan G，Xu C，et al.Invariant NKT cells promote alcohol-induced steatohepatitis through interleukin-1 beta in mice[J].J Hepatol，2015，62（6）：1311-1318.

[13]万远太，陈瑶.Cystatin C在大鼠酒精性肝病中的表达及意义[J].胃肠病学和肝病学杂志，2011，20（7）：624-627.

[14]程海涛.肝脏酶谱对肝病类型及预后的临床诊断价值研究[J].现代诊断与治疗，2015，26（2）：419-420.

[15]袁世伟，郑卫东.肝脏酶谱检测在诊断肝病中的应用及其临床意义[J].临床和实验医学杂志，2012，11（23）：1884-1885.

[16]仝君，童师雯，王丹，等.HBV感染者血清AST/ALT比值及HBV血清标志物联合检测的辅助诊断价值研究[J].标记免疫分析与临床，2011，18（1）：8-11.

[17]曹智丽，周俊英，王娟，等.酒精性肝病大鼠肝组织PPARα 表达及意义[J].山东医药，2016，56（24）：31-33.

[18]郭丽英，李亚敏，李青春.酒精性脂肪肝大鼠模型肝组织中HIFs/PPAR信号通路激活程度与脂质代谢的关系[J].海南医学院学报，2015，21（11）：1459-1462.

[19]邬升，郑世华，仝巧云.酒精性肝病发病机制的研究进展[J].实用医学杂志，2013，29（12）：2049-2050.

[20]杨万枝.酒精性肝病发病机制研究进展[J].安徽医科大学学报，2012，47（1）：97-99.

Establishment of early experimental model for liver injury of alcoholism in rats

CHEN Huan1LIU Yan-ling1LIU Xue-rui1CAI Si-yu1WANG Jia-min1LIU Lan2▲
1.Basic Medicine Department,Southwest Medical University,Sichuan Province,Luzhou 646000,China;2.Department of Cell Biology and Genetics,Southwest Medical University,Sichuan Province,Luzhou 646000,China

[Abstract]ObjectiveTo explore the method of establishing a model of early alcoholic liver disease （ALD）in rats in order to provide an ideal animal model for studying the molecular mechanism of early alcoholic liver injury.MethodsTwenty-four male SD rats were randomly divided into experimental group (16 rats)and control group (8 rats).In the control group,SD rats were fed with tap water.In the experimental group,SD rats were fed with alcohol of which the concentration of 7%-56%increased gradually for 12 weeks.During the experiment,the quantity of the fodder and the value of drinking were recorded everyday.Then the weight was weighed every week.24 and 12 hours before rats in experimental group were killed,they were treated with acute lavages with 56%alcohol.The activities of alanine aminotransferase （ALT）,spartate aminotransferase （AST）,riglyceride （TG） and total cholesterol （TC） in serum were determined by the fully automatic biochemical analyser.Moreover,the histological and morphological changes of liver tissues were observed.ResultsThe growth rate of body mass was （160.09±3.12）%in the control group at the end of 12thweek,while it was（61.67±1.98）%in the experimental group （P＜0.05）.The ratio of liver body weight of the experimental group （3.74±0.54） was obviously increased compared with the control group （2.85±1.26）（P＜0.05）.Compared with the control group,the levels of AST,ALT,TG and TC of the model group were clearly increased （P＜0.05）.Meanwhile,the typical fatty liver pathologic changes,local inflammation and necrosis were observed in experimental group.ConclusionThe results show that the ALD model with low mortality is stable and easy to copy,which is highly similar to the early ALD in human,and can be used in the study of ALD.

[Key words]Alcoholic liver disease;Rat;Liver disease model;Hepatic function

[中图分类号]R575

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）07（b）-0007-04

（收稿日期：2017-04-12 本文编辑：任 念）

[基金项目]国家级大学生创新创业训练项目（201410632022）

[作者简介]陈欢（1994-），女，2013级西南医科大学临床医学院本科在读

▲通讯作者：刘岚（1976-），女，硕士，副教授，从事医学细胞生物学与医学遗传学相关研究