梁俊君1王亚冰2辛海滨1刘 伟3▲

1.青岛大学医学院，山东青岛 266071；2.首都医科大学宣武医院神经外科，北京 100053；3.青岛大学医学院附属医院神经外科，山东青岛 266071

[摘要]目的探讨重组人促红细胞生成素rhEPO是否通过JAK2/STAT5信号通路减少脑出血后神经细胞的凋亡。方法将8周龄的Wistar雄性大鼠30只随机分3组：假手术组、ICH模型组、rhEPO组，每组10只。ICH模型组大鼠进行ICH造模，假手术组除不注血外，其余步骤同ICH模型组，rhEPO组术后5 min给予腹腔注射rhEPO，所有动物24 h后进行神经功能学评分，收集大鼠脑组织，利用原位缺口末端标记法检测神经细胞凋亡的变化；采用免疫组织化学SP法检测凋亡蛋白Caspase3表达；并采用Real-time PCR和Western blot检测磷酸化JAK2、磷酸化STAT5基因和蛋白表达情况。结果手术建立脑出血模型后24 h进行神经功能评分。按Longa5分制标准判定，ICH组4只评价为1分，3只评价为2分，2只评价为3分；rhEPO组治疗后，5只评价为1分，2只评价为2分，1只评价为3分，说明rhEPO可以改善大鼠脑出血后神经元损伤，恢复神经功能。与假手术组相比，ICH模型组和rhEPO组中神经元凋亡细胞及Caspase3的蛋白表达阳性细胞数明显增多（P<0.05），而rhEPO组中凋亡细胞与ICH模型组相比明显减少（P<0.05）；与假手术组相比，ICH模型组和rhEPO组中JAK2和STAT5的蛋白表达和mRNA表达显著上升（P<0.05），与ICH模型组相比，rhEPO组中JAK2和STAT5的蛋白表达和mRNA表达显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论外源性rhEPO可以通过调节JAK2/STAT5信号改善大鼠脑出血后神经元损伤，对于神经系统具有保护作用。

[关键词]rhEPO；脑出血；神经保护；JAK2/STAT5信号通路

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是脑卒中中的第二大类疾病，脑卒中患者中15%的患者是脑出血疾病[1]。脑出血特点是进展较快、高致残率和高死亡率[2]。据报道，脑出血病号的死亡率高达40%，脑出血后细胞的死亡会造成脑出血后对脑的二次损伤[1]。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是调节血细胞生成的一种细胞因子，之前的研究报道表明EPO对脑以及身体其他器官有保护作用。EPO对实验性的脑梗死、缺血再灌注损伤均有保护作用[3-4]。EPO可以通过磷酸化激活AKT信号通路提高脑损伤后神经细胞的生存率[5]，但对于EPO是否可以保护脑出血后神经细胞以及相应的机制研究较少。本实验旨在探讨外源性rhEPO对于神经系统的保护作用，采用大鼠脑出血ICH模型，观察重组人红细胞生成素（rhEPO）对大鼠脑ICH模型治疗后，对神经细胞凋亡以及凋亡相关蛋白Caspase3表达的影响，并探讨相关作用机制。

1.1 主要试剂与仪器

重组人促红细胞生成素购自上海索宝生物科技有限公司；实时荧光定量PCR仪-7500购自美国Thermo Fisher公司；电泳设备购自Major Science；多克隆Caspase3、JAK2、STAT5一抗购自美国abcam试剂公司；碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG二抗购自上海安驰生物科技有限公司；DAB显色试剂盒和TUNEL凋亡试验盒购自上海索宝生物科技有限公司；蛋白浓度测定使用BCA试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验动物与分组处理

8周龄SPF级雄性Wistar大鼠30只（购买于北京维通利华实验动物技术有限公司）。大鼠饲养在SPF级动物实验室，温度为（22±2）℃，12 h/12 h昼夜循环光照。大鼠构建脑出血ICH模型后随机分为3组：假手术组、ICH模型组和rhEPO组，每组10只。

1.3 方法

1.3.1 ICH模型的制备 腹腔注射10%的水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉大鼠，将大鼠固定于脑立体定位仪上，消毒切开头皮，微量注射仪取大鼠自体不凝血50 μl，而后匀速缓慢2～3 min注入右侧大鼠尾状核部位，留针10 min再缓慢拔出，缝合切口。治疗组术后腹腔注射rhEPO（3000 IU/kg），假手术组步骤同上，仅不注射血。假手术组与ICH模型组术后腹腔注射0.5 ml生理盐水。

1.3.2 脑标本采集与组织切片制备 大鼠用10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）腹腔注射麻醉后，依次用4℃生理盐水400 ml，4%多聚甲醛400 ml进行心脏灌注。取脑后用4%多聚甲醛固定48 h后，常规脱水、透明及浸蜡包埋，制备厚度为5 μm的石蜡切片，分别用于免疫组织化学染色及TUNEL凋亡检测。

1.3.3 神经功能评分 手术后功能缺损按Longa5分制标准进行评分。0分：无明显神经病学症状；1分：不能完全伸展左前肢；2分：向左侧旋转；3分：行走时向左侧倾倒；4分：不能自行行走，有意识障碍。ICH造模后24 h检测动物的神经功能评分。

1.3.4 TUNEL原位凋亡细胞检测 3%浓度 H2O2室温孵育石蜡切片10 min，37℃下用蛋白酶K消化10 min。37℃加入标记液孵育2 h，室温加封闭液孵育30 min。加入生物素化抗地高辛抗体室温孵育30 min，SABC试剂加入其中恒温37℃反应30 min，DAB显色液加入其中进行显色，用显微镜进行观察。凋亡阳性细胞为细胞核含有棕黄色颗粒者，每张切片计数5个视野，计算切片凋亡细胞数。

1.3.5 免疫组织化学法检测Caspase3表达 PBS洗涤切片3次，室温下滴入血清进行封闭30 min，而后滤纸吸取残留的血清，加入一抗 Caspase3（1∶500）孵育过夜，隔夜复温45 min，PBS洗涤3次，二抗 （1∶1000）孵育30 min，PBS洗涤三次，加入SP室温反应30 min，加入DAB显色液。显微镜观察。细胞核中含有棕黄色颗粒为阳性，取5个视野，计算切片中的表达Caspase3的阳性细胞数目。

1.3.6 Western blot检测磷酸化JAK2、STAT5的表达量 按照100∶1的比例混合裂解液与PMSF，裂解液裂解大脑组织后，低温离心10 min，转速为12 000 r/min，用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，调整各组的蛋白总量为30 μg/μl。取各组样品加入电泳槽中进行电泳，基层胶 20 min、80V，分离胶 60 min、120 V，按蛋白分子量大小切胶，转膜，用BSA封闭PVDF膜1 h，加入一抗（1∶500），4℃孵育过夜，隔夜室温下用 TBST 洗膜3次，加入二抗（1∶1000），孵育 1 h，用 TBST 洗膜 3次，加入显色液进行显色3 min，用Quantity-one软件以及Bio-Pro凝胶成像分析仪成像对各条带进行灰度扫描从而得出相应蛋白表达量。

1.3.7 Real-Time PCR检测大鼠JAK2、STAT5 mRNA表达含量 用Trizol提取中脑组织RNA，用Prime ScriptRRT试剂盒逆转录合成cDNA（购自TaKaRa公司），用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行Realtime PCR操作（购自TaKaRa），其引物序列为：JAK2——F：5′-GCTCCTCTCCTTGACGACTTT-3′，R：5′-ACCTTATCCGCTTCCGAGTTA-3′；STAT5——F：5′-GGGCATCACCATTGCTTGGAAG-3′，R：5′-GGAGCTTCTGGCAGAAGTGAAG-3′；Β-ACTIN——F：5′-TGGGTCAGAAGGACTCCTATG-3′，R：5′-CAGGCAGCTCATA-GCTCTTCT-3′。

PCR 反应获得阈值循环数（cycle threshold，CT），而后采取CT值比较法，即利用起始cDNA浓度的对数与CT值成反比关系，从而计算出不同样本之间的相对百分数。 公式为 ΔΔCT=（CT.实验组目的基因-CT.实验组管家基因）-（CT.对照组目的基因-CT.对照组管家基因）。 目的基因的 mRNA 的量=2-ΔΔCT。

1.4 统计学处理

数据使用统计分析软件SPSS 13.0进行处理，计量资料用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 各组的神经功能评分

如表1所示，手术建立脑出血模型后24 h进行神经功能评分。按Longa5分制标准判定，ICH模型组4只评价为1分，3只评价为2分，2只评价为3分；rhEPO组治疗后，5只评价为1分，2只评价为2分，1只评价为3分，说明rhEPO可以改善大鼠脑出血后神经元损伤，恢复神经功能。

2.2 TUNEL凋亡检测结果

如图1所示，假手术组仅仅见到极少量凋亡细胞，ICH模型组和rhEPO组凋亡细胞明显增多。图2表示TUNEL原位凋亡细胞检测凋亡细胞数的变化，与假手术组相比，ICH模型组和rhEPO组中凋亡细胞明显增多（P<0.05）；与ICH模型组相比，rhEPO组中凋亡细胞明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 Caspase3免疫组织化学结果

由图3可知，假手术组、ICH模型组和rhEPO组的Caspase3蛋白的染色强度差异有统计学意义 （P<0.05）。如图4，免疫组织化学的光密度结果分析显示，ICH模型组和rhEPO组中的Caspase3蛋白表达含量均比假手术组中的蛋白表达有显著增加（P<0.05）。与ICH模型组中的Caspase3蛋白表达含量相比，rhEPO组中的Caspase3表达含量显著降低（P<0.05）。

2.4 JAK2、STAT5蛋白表达水平

如图5，与假手术组相比，ICH模型组和rhEPO组中JAK2、STAT5的蛋白表达量显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与ICH模型组相比，rhEPO组中的JAK2、STAT5蛋白表达量显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），说明rhEPO组可以调节JAK2/STAT5信号通路的蛋白水平改善大鼠脑出血后神经元损伤。

2.5 JAK2、STAT5 mRNA表达水平

如图6，与假手术组相比，ICH模型组和rhEPO组中JAK2、STAT5的mRNA表达量显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）；与ICH模型组相比，rhEPO组中的JAK2、STAT5 mRNA表达量显著下降，差异有统计学意义 （P<0.05），说明 rhEPO组可以调节 JAK2/STAT5信号通路的基因水平来缓解大鼠脑出血后神经元损伤。

随着人群年龄的增长，脑出血的发生率显著升高，致残致死率高[6]。脑出血后原发性的脑损伤主要是由于脑血肿对于邻近脑组织的损伤，脑出血后继发性的损伤也是脑出血后病人神经功能的损伤的重要原因[7]。继发性的脑损伤原因包括细胞死亡、脑水肿、血脑屏障的破坏，相关机制包括炎症反应、细胞毒性、细胞凋亡后释放的物质、酶活性的抑制等[8]。脑出血后各种酶的变化也会导致细胞的凋亡[7，9-10]，因此，抑制细胞凋亡、保护神经细胞是治疗脑血管病的重要基础。EPO是一种存在于人体内的一种糖蛋白，具有提高造血的功能。最近研究表明，EPO可以促进神经系统再生以及抑制细胞凋亡、提高细胞生存率[11]。之前有报道称，EPO可以通过磷酸化激活AKT促进神经细胞的存活。有研究表明，EPO及促红细胞生成素受体在脑组织中均有表达[12]，并且rhEPO预处理对体外培养的神经细胞有明显的保护作用，EPO具有保护神经细胞的作用[13-14]。作为一个最新的保护因子，其保护作用及其机制引起大量的研究。但是EPO在脑出血中的作用及其相关机制研究较少[15]。

脑出血之后血肿周围的细胞会出现凋亡[16]。其中信号通路是多种细胞因子和生长因子等的共同通路[17]，应激反应时，JAK2/STAT5的信号传导可以与胞膜上的 JAK结合位点，并促使 STAT磷酸化，完成与目的基因的信号传导和表达调控[18]。JAK-STAT在细胞的凋亡、分化、增殖以及各种中枢神经系统疾病中具有重要作用[19-20]。

本研究结果显示，凋亡细胞数和Caspase3的蛋白表达阳性细胞数在ICH模型组和rhEPO组中显著增多，说明在ICH模型组和rhEPO组中，脑出血模型建立成功，并且神经元损伤较多，细胞凋亡发生明显。但与ICH模型组相比，rhEPO组中凋亡细胞和Caspase3的蛋白表达阳性细胞数明显减少，说明rhEPO具有神经保护作用，可以产生抗细胞凋亡的作用。ICH模型组和 rhEPO组中 JAK2、STAT5的蛋白和mRNA表达量显著增高，说明脑出血过程中JAK2/STAT5信号通路参与了神经损伤过程；而与ICH模型组相比，rhEPO组中的JAK2、STAT5蛋白和mRNA表达量显著下降，说明rhEPO组可以调节JAK2/STAT5信号通路的蛋白和mRNA水平改善大鼠脑出血后神经元损伤。本实验结果说明JAK2、STAT5的显著性表达参与了脑出血ICH发生的重要阶段，可以通过促进细胞凋亡过程导致神经细胞损伤。而rhEPO可以通过调节JAK2/STAT5信号通路来缓解神经细胞损伤，在神经细胞保护抗凋亡过程中起重要作用。

综上所述，rhEPO的神经保护作用机制可能是JAK2/STAT5信号机制通路所介导的抗凋亡的作用。研究rhEPO在脑出血发生后产生保护作用的具体机制，对减少脑出血后减少细胞凋亡，保护神经细胞，促进神经功能的恢复有着重要意义，可以为临床治疗提供有效的帮助。

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rhEPO reduces neuron apoptosis after intracerebral hemorrhage in rats by regulating JAK2/STAT5 signaling

LIANG Jun-jun1WANG Ya-bing2XIN Hai-bin1LIU Wei3▲
1.Medical College of Qingdao University in Shandong Province,Qingdao 266071,China;2.Department of Neurosurgery,Xuanwu Hospital of Capital Medical University,Beijing 100053,China;3.Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College in Shandong Province,Qingdao 266071,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate whether recombinant human erythropoietin(rhEPO)could decrease neuron apoptosis after cerebral hemorrhage by regulating JAK2/STAT5 signaling pathway.Methods30 Wistar male rats of 8 weeks old were randomly divided into 3 groups:sham operation group,ICH model group and rhEPO group,the rats in ICH model group were treated with ICH.In the sham operation group,the treatment were same as ICH group except blood injection.rhEPO group was injected with rhEPO at 5 min after operation.All animals were scored with neurological score at 24 h after the ICH model was established.The effect of neuronal apoptosis were detected by TUNEL staining.The expression of pro-apoptosis protein Caspase3 was detected by immunohistochemistry.The expressions of JAK2 and STAT5 mRNA and protein were measured by Real time PCR and Western blot.ResultsNeurological score was performed 24 hours after the establishment of the intracerebral hemorrhage model.According to the criteria of Longa5 standard,in ICH group,four rats were evaluated as score 1,three rats were rated as score 2 and two rats were rated as score 3.In rhEPO group,five rats were evaluated as score 1 and two rats were rated as score 2,one rat were rated at score 3,indicating that rhEPO can ameliorate neuronal damage and restore nerve function after intracerebral hemorrhage in rats.Compared to sham group,the quantity of apoptotic cells and the expression of Caspase3 in ICH model group and rhEPOgroup were significantly increased(P＜0.05),while the apoptotic cells in rhEPO group were significantly down-regulation compared with the ICH group (P＜0.05).Compared with the sham group,the protein expression and mRNA expression of JAK2 and STAT5 in ICH group and rhEPO group were significantly up-regulated (P＜0.05),while the protein expression and mRNA expression of JAK2 and STAT5 in rhEPO group were decreased significantly compared to ICH group(P＜0.05).ConclusionrhEPO reduce neuronal apoptosis by regulating JAK2/STAT5 signal after cerebral hemorrhage,and has protective effect on the nervous system in rats.

[Key words]rhEPO;Intracerebral hemorrhage;Neuroprotection;JAK2/STAT5 signal pathway

[中图分类号]R332

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）06（a）-0008-05

（收稿日期：2017-03-17 本文编辑：许俊琴）

[基金项目]山东省医药卫生科技发展计划项目（2013WS0012）