周飞燕 孔雯雯 杨丽菲

广州白云山拜迪生物医药有限公司，广东广州 511495

[摘要]目的建立注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）冻干粉针剂中主要活性成分的HPLC的测定方法。方法HPLC色谱条件中，色谱柱为TSK gel G3000SW（300.0 mm×7.5 mm，5 μm），流动相为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，流速为1 ml/min，自动进样20～40 μl，检测波长为280 nm。研究该色谱条件是否能分析rhGM-CSF冻干粉针剂中的各组分、实验重现性以及不同进样体积与各组分峰面积的线性关系。结果检测出rhGM-CSF冻干粉针剂中的主成分为rhGM-CSF蛋白和人血白蛋白，rhGM-CSF蛋白进样量与峰面积呈良好线性关系，R2＞0.99，百分含量的RSD值均＜3%。结论 该法可用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂蛋白量在10～20 μg范围内的的活性成分含量。

[关键词]重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；冻干粉针剂；高效液相色谱法

重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子冻干粉针剂（rhGM-CSF）是使用重组基因工程技术生产的重组蛋白药物[1]343-344，是一种细胞因子，主要用于治疗因放、化疗引起的白细胞减少[2-5]，并且临床上可以治疗溃疡、烫伤、烧伤等创面疾病[6-9]，其活性成分为重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，该品种已被《中国药典》三部收载[1]343-344。《中国药典》未规定其成品的含量测定方法，只要求测定生物学活性（效价），采用的是TF-1依赖细胞株，用MTT染色法进行测定，合格范围是标示活性的80%～150%[10]96-98，277-279。由于活性测定方法本身的稳定性较差，难以实现精确的控制，因此，为更好地控制产品质量，宜尽早建立其主药成分含量测定方法。

高效液相色谱法（HPLC）中收载rhGM-CSF原液纯度的检测方法，是采用凝胶色谱柱为固定相，磷酸盐缓冲液为流动相，在波长280 nm处进行检测，使用面积归一化法计算目的蛋白百分比含量[10]59-63。目前，高效液相用于药品的定性、定量的分析应用已经很广泛[11-15]，但是用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂主药含量的方法尚罕见报道，故本研究通过参考药典中rhGM-CSF原液纯度检测的方法，确认该法检测rhGM-CSF冻干粉针剂主药含量的可行性。

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪（配有G1315B DAD检测器、G1311A四元梯度泵、G1322A在线脱气装置、G1316A柱温箱，德国安捷伦科技有限公司）；化学工作站（ChemStation，版本号：Rev.A.10.01[1635]，美国安捷伦科技有限公司）；BS124S型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；TSK gel G3000 SWXL色谱柱（7.8 mm×300 mm，粒径5 μm，日本东曹株式会社公司）。

1.2 主要试剂

二水磷酸氢二钠（AR，西陇化工股份有限公司）；氯化钠（AR，广州化学试剂厂）；十二水合磷酸二氢钠（AR，西陇化工股份有限公司）；甲醇（色谱级，Merck KGaA）；人血白蛋白（注射级，上海莱士血液制品股份有限公司）；甘露醇注射液（注射级，华润双鹤药业股份有限公司）；PEG4000（药用级，南京威尔化工有限公司）。

rhGM-CSF原液（批号20151003，广州白云山拜迪生物医药有限公司自制）。rhGM-CSF冻干粉针剂（批号20130201，规格100 μg/瓶，广州白云山拜迪生物医药有限公司自制）。

2.1 色谱条件

色谱柱：TSK gel G3000 SWXL（十二水磷酸二氢钠6.08 g、十二水合磷酸氢二钠21.85 g、氯化钠5.844 g，三者定容至1000 ml，摇匀。经0.45 μm的滤膜过滤后备用；检测波长：280 nm；流速：1 ml/min；柱温：25℃。

2.2 样品准备

用流动相将rhGM-CSF冻干粉针剂和人血白蛋白配制成浓度为0.5 mg/ml的溶液；将rhGM-CSF原液制备成浓度为1.0 mg/ml的溶液；甘露醇注射液稀释成20%的浓度后备用。以上样品进样前需经过离心（10 000 r/min，5 min）后，取上清液适量体积加入进样小瓶备用。

2.3 rhGM-CSF冻干粉针剂中的各组分HPLC分析

rhGM-CSF冻干粉针剂主要由rhGM-CSF原液（主成分为rhGM-CSF蛋白）、人血白蛋白、甘露醇注射液组成。分别取1.0 mg/ml rhGM-CSF原液、0.5 mg/ml人血白蛋白、20%的甘露醇注射液单组分以及0.5 mg/ml rHGM-CSF冻干粉针剂进行HPLC分析，进样体积分别为20 μl。根据HPLC图谱确立rhGM-CSF冻干粉针剂中各组分对应的峰及其保留时间，试验结果详见图1～图4。

 

图1 rhGM-CSF原液色谱图液色谱图

 

图2 人血白蛋白液色谱图液色谱图

 

图3 甘露醇注射液色谱图

 

图4 rhGM-CSF冻干粉针剂色谱图

检测结果显示，rhGM-CSF原液于11.072 min出现吸收峰，人血白蛋白于5.824、8.296、9.399、14.756、15.021 min出现吸收峰，甘露醇注射液于12～13 min出现了倒峰。RHGM-CSF冻干粉针剂则在5.843、8.274、9.396、10.999、14.900 min出现吸收峰，在12～13 min也出现了倒峰。结合HPLC分析方法自身的系统误差，推测rhGM-CSF冻干粉针剂中保留时间为5.843、8.274、9.396、14.900 min的吸收峰是人血白蛋白的不同聚合体的样品峰。人血白蛋白单组分在保留时间为14.756、15.021 min时出现了两个吸收峰，推测以液体和冻干粉状态贮存的人血白蛋白的稳定性存在差异，导致其注射液经长期存放后出现了分裂峰。12～13 min的倒峰推测为甘露醇，由于甘露醇吸光度小于流动相导致了倒峰的产生，表明该体系不适用于甘露醇的分析。rhGM-CSF冻干粉针剂中保留时间为10.999 min的单峰推测为rhGM-CSF目的蛋白。

2.4 rhGM-CSF冻干粉针剂结果的重现性

取0.5 mg/ml的rhGM-CSF冻干粉针剂 （批号20130201），平行进样3次，进样体积40 μl（对应rhGMCSF蛋白的含量为20 μg），根据面积归一化法计算各组分的峰面积（area）及相应的百分含量（area%），并计算其RSD（%）。结果显示，该法分析rhGM-CSF冻干粉针剂，各峰的平行性较好，峰面积及峰面积百分比RSD均＜1%（表1）。

表1 rhGM-CSF冻干粉针剂峰面积、RSD及面积百分比、RSD分析

 

mAU×s表示为安捷伦工作站的峰面积单位，即为电压（mAU）与时间（s）的乘积

2.5 不同进样体积与各组分峰面积的线性关系

取制备好的0.5 mg/ml rhGM-CSF冻干粉针剂（批号20161201），根据不同进样体积的分析结果，如不同进样量的各峰的保留时间、峰面积、百分含量及相应的RSD值，研究不同进样量与相应峰面积的线性关系（进样量为20～40 μl，对应10～20 μg的rhGMCSF蛋白）。

2.5.1 rhGM-CSF冻干粉针剂中第1个峰 （人血白蛋白）的HPLC分析 保留时间约为5.8 min的HPLC分析数据见表2，不同的进样体积与各组分的百分含量进行拟合线性回归，R2值为0.9999。

表2 rhGM-CSF冻干粉针剂第1个峰的HPLC分析数据

2.5.2 rhGM-CSF冻干粉针剂中第2个峰 （人血白蛋白）的HPLC分析 保留时间约为8.2 min的HPLC分析数据见表3，不同的进样体积与各组分的百分含量进行拟合线性回归，R2值为0.9979。

表3 rhGM-CSF冻干粉针剂第2个峰的HPLC分析数据

2.5.3 rhGM-CSF冻干粉针剂第3个峰（人血白蛋白）的HPLC分析 保留时间为9.3 min的HPLC分析数据见表4，不同的进样体积与各组分的百分含量进行拟合线性回归，R2值为1。

表4 rhGM-CSF冻干粉针剂第3个峰的HPLC分析数据

2.5.4 rhGM-CSF冻干粉针剂第4个峰 （rhGM-CSF蛋白）的HPLC分析 保留时间约为 11.0 min的HPLC分析数据见表5，不同的进样体积与各组分的百分含量进行拟合线性回归，R2值为0.9999。

表5 rhGM-CSF冻干粉针剂第4个峰的HPLC分析数据

2.5.5 rhGM-CSF冻干粉针剂第5个峰（人血白蛋白）的HPLC分析 保留时间为14.9 min的HPLC分析数据见表6，不同的进样体积与各组分的百分含量进行拟合线性回归，R2值为0.9964。

表6 rhGM-CSF冻干粉针剂第5个峰的HPLC分析数据

3.1 蛋白质含量测定方法比较

蛋白质含量测定法[10]96-98主要有凯氏定氮法、lowry法、双缩脲法、考马斯亮蓝（Brandford）法、BCA法、紫外-可见分光光度法等，其中凯氏定氮法与双缩脲法需要较大量的蛋白样品，并且双缩脲法需要蛋白浓度也较高；紫外吸收法测定低浓度的蛋白时准确度较差；考马斯亮蓝G-250染色（Brandford）法一般只用于蛋白粗略定量。上述蛋白测定方法属于非特异性的反应，当产品有蛋白类添加剂（比如人血白蛋白）时就完全不适用。并且重组蛋白药物剂量很小，一般为微克级，需要应用更灵敏的检测方法。

3.2 HPLC检测法对混合组分的适用性

本文采用HPLC法对rhGM-CSF冻干粉针剂及其单组分进行检测，结果表明，该法可检测出rhGMCSF冻干粉针剂中的主成分rhGM-CSF蛋白和人血白蛋白，各峰之间的分离度较好；HPLC方法的重现性较好，相同进样体积条件下，其峰面积及峰面积百分比的RSD均＜1%；不同进样量（20～40 μl）与各组分的峰面积显示明显线性关系，R2均＞0.99，故该法可用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂中的活性成分的含量百分比。另外，由于不同样品的峰面积与其进样量呈一定的线性关系，还可在一定范围内根据rhGM-CSF蛋白峰面积的变化，推测其对应的含量。

应用HPLC法检测rhGM-CSF冻干粉针剂中rhGM-CSF含量，是原液评价的一种直观、合理、有效的技术手段，具有重现性好和操作简便等优点，能很好地满足质控的要求，对完善该品种的质量标准提供了参考。

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Application of content determination of principal agent in recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor freeze-dried powder injection by HPLC

ZHOU Fei-yan KONG Wen-wen YANG Li-fei
Guangzhou Baiyunshan Baidi Bio-Technology CO.,Ltd,Guangdong Province,Guangzhou 511495,China

[Abstract]ObjectiveTo establish the method of the main active ingredients in recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor freeze-dried powder injection(rhGM-CSF)by HPLC.MethodsThe chromatographic condition of HPLC was chromatographic column(TSK gel G3000SW,300.0 mm×7.5 mm,5 μm),Mobile phase was 0.1 mol/L phosphate buffer,Flow rate was 1 ml/min,automatic sampling was 20-40 μl and detection wavelength was 280 nm.Analyzing the ingredients of rhGM-CSF freeze dried powder injection,reproducibility and linear relationship between different sample volume and peak area of each component under this chromatographic condition were studied in this experiment.ResultsThe main components of rhGM-CSF freeze dried powder injection were rhGM-CSF protein and human albumin.The rhGM-CSF protein sample volume and peak area were good linear(R2＞0.99)and the percentage content of RSD values was less than 3%.ConclusionThis method could be used to detect the active component content of the rhGM-CSF lyophilized powder for injection protein with 10-20 μg scope.

[Key words]Recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor;Freeze-dried powder injection;High performance liquid chromatography

[中图分类号]R927.2

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）05（c）-0104-04

（收稿日期：2017-03-16 本文编辑：祁海文）