许海涛1刘良田2唐永华1李 屏3

1.深圳市光明新区人民医院检验科，广东深圳 518106；2.深圳市宝安区石岩人民医院检验科，广东深圳 518108；3.深圳市宝安区石岩人民医院病理科，广东深圳 518108

[摘要]目的 探讨同源基因IRX1在原发性肝癌中的表达及其临床意义。方法 选取2014年5月～2016年5月于深圳市光明新区人民医院和深圳市石岩人民医院行手术治疗的肝癌患者30例为观察组，同期选取30例志愿者或肝脏良性病变者为对照组。制备标本后行IRX1基因在肝脏组织中mRNA转录水平的检测、IRX1蛋白表达水平的检测，比较两组病例IRX1表达的差异。结果对照组肝脏标本组织中IRX1蛋白的表达及转录水平与对照组差异有统计学意义（P＜0.05），观察组中高、中、低分化的IRX1蛋白的表达分别是对照组的1.90、3.31、3.33倍，观察组中高、中、低分化转录水平分别是对照组的2.95、1.83、4.46倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；观察组标本组织中IRX1阳性率明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），两组病例的并发症比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论同源基因IRX1参与了肝癌的发生、发展过程，且表达与肝癌的分化程度相关，IRX1可作为临床判断病情的指标。

[关键词]原发性肝癌；同源基因；转录；表达

原发性肝癌是临床较为常见的恶性肿瘤，其在恶性肿瘤中的致死率居于第三位，据报道，每年约70万人口死于肝癌，其中一半以上的患者源自我国[1-2]。原发性肝癌的发生给患者的生命安全造成了极大的威胁[3]。目前，对该疾病的研究也不断深入，但发生、发展分子机制的研究仍然属于发展阶段，因此肝癌细胞的生长、繁殖、转移与分子机制的关系仍需进一步研究。以往的研究结果显示，易洛魁家族同源盒（IRX）基因在肿瘤的生长繁殖过程中起癌基因或者抑癌基因的作用[4-5]。本研究主要探讨同源基因IRX1在原发性肝癌中的表达及其临床意义，现报道如下。

1.1一般资料

选取2014年5月～2016年5月于深圳市光明新区人民医院和深圳石岩人民医院行手术治疗的肝癌患者30例为观察组。纳入标准：①均经病理学检验证实为肝癌；②未接受放疗或化疗治疗；③肝癌组织及癌旁组织标本于手术后立即取材；④签署知情同意书。排除标准：①诊断为肝癌，但未行手术治疗者；②未取病理活检者；③拒绝加入本研究者。同期选取30例健康志愿者或肝脏良性病变者作为对照组。观察组中，男性患者18例，女性患者12例；年龄48～75岁，平均（59.31±5.48）岁；根据Edmondson分级方法[6]对入组患者进行分级：Ⅰ级（高分化）13例，Ⅱ级（中分化）10例，Ⅲ级（低分化）7例；乙肝病毒阳性9例，伴随肝硬化17例。对照组中，男性患者19例，女性患者11例；年龄50～75岁，平均（59.57±5.51）岁。健康志愿者17例，肝炎患者8例，肝硬化患者5例。两组患者的年龄、性别等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准通过。

1.2标本收集

在患者行肝脏手术的过程中，取癌组织、癌旁组织和远癌肝组织，一部分行病理检查，一部分用于制备标本待检，癌组织选取部位的划分为：癌组织是指肉眼所见的肿瘤部位，癌旁组织是指在肿瘤边界2 cm范围内的非癌组织为癌旁组织，距肿瘤2 cm以上的范围为远癌肝组织。将取得的组织制备成0.5 cm×0.5 cm大小的组织块，并迅速置于液氮罐中，-80℃低温冰箱内保存，以备检测。

1.3检测方法

1.3.1试剂与仪器 逆转录试剂盒和RNAiso Plus购自美国Bio-Rad公司，HRP标记的山羊抗兔IgG和Transblot半干转电泳槽购自北京中杉金桥生物技术有限公司，反转录试剂购自日本TaKaRa公司，兔抗人IRX1单克隆抗体购自北京百泰克生物有限公司，兔抗人βactin单克隆抗体购自美国Bioworld生物工程公司，免疫组化试剂盒（SP）购自北京中山金桥有限公司。

1.3.2 IRX1基因在肝脏组织中mRNA转录水平的检测 标本制备完成后，运用离心柱法将组织标本的RNA提出出来，并逆转录合成cDNA，进行实时荧光定量PCR，取出质量约为80 mg的标本，将研磨后的液氮加入1 ml RNAiso Plus试剂中，按照说明书的步骤操作提取RNA，反转录后，于-0℃保存。IRX1基因所选用的引物如下。上游：5′-CAGATGGGCTCGCAGTATGAAC-3′，下游：5′-CCTTGAGCGTGCTGGTGTTCT-3′。反应的条件为在95℃的环境下预变性3 min，并于该温度下进行变性10 s，于55℃的环境下退火30 s，并以此过程为循环进行操作，共重复40个循环，每个样本设3个复孔。

1.3.3肝脏组织中IRX1蛋白表达水平的检测 运用Western blot法。以12 000 r/min的速度离心5 min，取上清液，行SDS-PAGE，加入兔抗人IRX1单克隆抗体（1∶2000稀释），于37℃的环境下作用1 h，然后洗涤，后给予加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀释），于37℃的环境下作用30 min，用ECLKit进行化学发光反应，成像系统记录结果。

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1两组肝脏标本组织中IRX1蛋白表达及转录水平的比较

观察组肝脏标本组织中IRX1蛋白表达及转录水平与对照组差异有统计学意义（P＜0.05），观察组中高、中、低分化的IRX1蛋白表达分别是对照组的1.90、3.31、3.33倍，观察组中高、中、低分化转录水平分别是对照组的2.95、1.83、4.46倍，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.2两组肝癌的定位及特征分析

观察组标本组织中IRX1阳性率明显高于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.531，P＜0.05），两组病例的并发症比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

原发性肝癌是临床较为常见的恶性肿瘤，发病率及致死率较高，影响了患者的正常生活[7-9]。在以往的工作中，肝癌的治疗以手术为主要治疗手段，其临床治疗效果也逐渐得到突破，但由于肝癌的发病比较隐匿，当患者出现自觉症状来就诊时往往已处于疾病的晚期，失去了最佳治疗时机，从而影响了治疗效果[7，10]，因此，本研究以上述研究背景为出发点，拟寻找早期诊断、判断预后的指标。

本研究结果显示，对照组肝脏标本组织中IRX1蛋白的表达及转录水平与对照组差异有统计学意义（P＜0.05），观察组中高、中、低分化的IRX1蛋白表达分别是对照组的1.90、3.31、3.33倍，观察组中高、中、低分化转录水平分别是对照组的2.95、1.83、4.46倍，差异有统计学意义（P＜0.05），提示肝癌患者与非肝癌患者体内的IRX1蛋白存在差异，且肝癌患者更高，因此，本研究推断，IRX1表达和转录与肝癌的发生和发展存在相关性，肝癌患者体内IRX1较高，或当体内IRX1较高时则提示肝癌的发生，宜及早医治[11-12]。IRX1在肿瘤的生长繁殖过程中发挥了重要作用，如头颈部鳞状细胞癌、胃癌、肺发育过程等，由于肿瘤性质的不同，IRX1发挥的作用也不同，如在头颈部鳞状细胞癌及胃癌中发挥的作用为抑癌基因[13-14]。目前，对IRX1与肝癌存在相关性的机制研究尚不完善，可能与下列因素有关：PAK1作为一种关键的分子参与了肝癌细胞增殖和凋亡过程，因此本研究人员推断，IRX1参与肝癌的形成过程可能是通过作用于MAPK信号通路中的靶点PAK1及其他的信号途径实现的[15-16]。

在肝癌患者的病理组织切片中，存在IRX1高表达，且与肿瘤的形成、生长、繁殖、转移等过程有关，但机制仍需进一步研究。

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Expression and clinical significance of homologous gene IRX1 in primary hepatocellular carcinoma

XU Hai-tao1LIU Liang-tian2TANG Yong-hua1LI Ping3
1.Department of Clinical Laboratory,People′s Hospital of Guangming New District in Shenzhen City of Guangdong Province,Shenzhen 518000,China;2.Department of Clinical Laboratory,Shiyan People′s Hospital of Baoan District in Shenzhen City of Guangdong Province,Shenzhen 518108,China;3.Department of Pathology,Shiyan People′s Hospital of Baoan District in Shenzhen City of Guangdong Province,Shenzhen 518108,China

[Abstract]ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of homologous gene IRX1 in primary hepatocellular carcinoma.Methods30 patients with liver cancer who were treated by operation in People′s Hospital of Guangming New District in Shenzhen City and Shiyan People′s Hospital of Shenzhen City from May 2014 to May 2016 were selected as observation group,at the same period,30 volunteers or patients with benign liver diseases were selected as control group.Detection of mRNA transcription level and detection of IRX1 protein expression in liver tissue after IRX1 gene was prepared,and the differences of IRX1 expression were compared between the two groups.ResultsThe expression and transcription level of IRX1 protein in the liver tissue of the control group were significantly different from that of the control group (P<0.05).In the observation group,the expression of IRX1 protein in high,middle and low differentiation was 1.90 times,3.31 times and 3.33 times of control group respectively.In the observation group,high,middle and low differentiation transcription level was 2.95 times,1.83 times,4.46 times as compared with that in control group,the difference was statistically significant(P<0.05).The positive rate of IRX1 in the observation group was significantly higher than that in the control group,the difference was statistically significant(P<0.05).There was no significant difference of complications between the two groups(P>0.05).ConclusionIRX1 is involved in the incidence and devel opment process of hepatocellular carcinoma,and its expression is correlated with the degree of differentiation of liver cancer.IRX1 can be used as an indicator for judge the state of an illness in clinic.

[Key words]Primary liver cancer;Homologous gene;Transcription;Expression

[中图分类号]R735.7

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）05（b）-0004-03

（收稿日期：2017-03-14本文编辑：许俊琴）

[基金项目]广东省深圳市宝安区医疗卫生科研项目（2016CX106）