陈江涛1，2，3李 健4潘雪峰3Urbano Monsuy Eyi5Rocio Apicante Matesa5Maximo Miko Ondo Obono5Carlos Sala Ehapo5查广才6黄 广6黄芝秀6林 敏1▲

1.汕头大学医学院组织胚胎教研室，广东汕头 515041；2.广东省惠州市中心人民医院检验医学中心，广东惠州516008；3.中国援赤道几内亚医疗队，广东广州 518000；4.湖北医药学院基础医学院，湖北十堰 442000；5.马拉博地区医院医学实验室，赤道几内亚马拉博 999115；6.韩山师范学院生命科学与食品科技学院，广东潮州 521041

[摘要]目的 研究赤道几内亚比奥科岛（Bioko Island）恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白1（PfMSP-1）基因和裂殖子表面蛋白2（PfMSP-2）基因分型。方法从比奥科岛采集疟疾患者血样181份，用显微镜法和荧光定量PCR鉴定虫种。采用巢式PCR分别扩增PfMSP-1和PfMSP-2中具有型特异性的片段，进行等位基因分型。结果PfMSP-1基因分型：181份恶性疟患者血样中有178份扩增出PfMSP-1基因片段（98.34%），其中K1、MAD20和RO33基因型片段分别为171份（94.48%）、175份（96.69%）和126份（69.61%）。混合感染率为97.24%；PfMSP-2基因分型：181份血样中有173份PfMSP-2基因片段（95.58%），其中48份（26.52%）单独扩增到3D7型基因片段，4份（2.21%）单独扩增到FC27型基因片段，混合感染率为66.85%。结论 赤道几内亚比奥科岛PfMSP-1和PfMSP-2等位基因型分布范围极广。混合感染是比奥科岛疟疾的主要类型。

[关键词]恶性疟原虫；裂殖子表面蛋白1；裂殖子表面蛋白2；比奥科岛

疟疾是严重危害人类健康和影响经济发展的虫媒传染病，在热带、亚热带以及温带部分地区广泛流行。疟疾主要分布于非洲的撒哈拉沙漠以南地区、东南亚以及加勒比海地区[1]。全世界每年约有2亿疟疾新发病例，导致约50万人死亡。非州中部的赤道几内亚共和国是全球疟疾感染最为严重的地区之一，该国绝大多数的疟疾病例是由恶性原虫感染导致的[2]。近五年来，尽管赤道几内亚的卫生部门实施了强有力的疟疾防控计划，但该地区的疟疾患病率仍然居高不下[3]。疟原虫的基因多态性是造成该地区防控措施进展缓慢的主要障碍之一[3]，因此，迫切需要我们去了解恶性疟原虫的临床分离株的基因多样性。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1（PfMSP-1）和2（PfMSP-2）是疟原虫裂殖子表面蛋白家族中的两个重要成员[4]，同时也是疟原虫裂殖子表面的两个非常重要的抗原，在疟原虫裂殖子侵袭红细胞时发挥重要的作用[5]，并能诱导宿主产生免疫应答反应，并被认为是极有希望发展出无性红内期重要的候选疫苗的组分[5-6]，因此用PfMSP-1和PfMSP-2作为分子标记，在疟疾分子流行病学研究上具有重要价值。一直以来，世界各地研究人员对PfMSP-1和PfMSP-2的基因多态性做了许多研究[5，7-8]，但目前未见任何关于赤道几内亚恶性疟原虫种群的MSP1和MSP2基因做了分型研究，为了解该岛恶性疟原虫虫株的基因类型和疟疾的分子流行病学研究和针对性的疫苗制备提供科学依据。

1.1血液样本

2011年1月～2014年12月，从赤道几内亚比奥科岛不同地区就诊于马拉博地区医院和地区诊断性诊所的患者中总共收集了181份恶性疟原虫感染血液样本。该研究得到马拉博地区医院（Malabo Regional Hospital）伦理委员会同意，同时取得每例患者的知情同意。

1.2疟原虫的鉴别和虫密度计算

采用WHO推荐的白细胞疟原虫计数法，在油镜下对吉姆沙染色后血涂片进行镜检。按照本实验室以往建立定量PCR及熔解曲线的方法进行虫种鉴定[9]，同时以四种疟原虫（间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫）的质粒为参照物。

1.3基因组DNA（gDNA）的提取

寄生虫的gDNA由利用Chelex-100提取方法[9]。用打孔器取直径5 mm干血斑，置于1.5 ml离心管，先加入l ml的无菌水浸泡2 h，然后16 000 r/min，离心5 min，弃上清；再加160 μl的5%的Chelex-100混悬液，56℃加热2 h，95℃变性8 min，振荡30 s，16 000 r/min，离心5 min，吸取上清，-20℃保存备用。

1.4 PfMSP-1和PfMSP-2基因的分型

按照PlasmoDB（http：//plasmodb.org），基因ID为PF3D7_0930300 and PF3D7_0206800的PfMSP-1和PfMSP-2序列合成各自的巢式PCR引物（表1）[10]。根据PfMSP-1基因2、3区重复序列数量和毗连序列类型的差异，可分为K1，RO33，MAD20三个基因型；根据PfMSP-2基因3区的部分片段，可分为3D7和FC27两个基因型。首先使用公用外部引物进行PCR扩增，接下来使用匹配于PfMSP-1三个基因型和PfMSP-2两个基因型的特异性引物分别进行扩增。第1次扩增反应用2 μl上述制备的DNA作模板，第2次扩增反应用2 μl第1次的反应产物作模板，其反应体系总体积为50 μl，其中含DNA模板2 μl，20 pmol/μl上下游引物各1 μl，1 μl的Taq聚合酶（东盛生物技术公司，广州）、10×Buffer（Mg2+Plus）5 μl、dNTP Mixture（各2.5 nm）4 μl、水36 μl；在伯乐Mini MJ PCR仪上进行试验，PCR反应条件如下：95℃变性3 min，93℃30 s-52℃ 30 s-72℃延伸 1 min（35个循环）；72℃延伸5 min。反应结束后，取10 μl PCR产物于2%琼脂糖电泳和EB染色后，用紫外分析仪观察结果并拍照。PCR产物的大小根据25～700 bp的DNA Marker（东盛生物技术公司，广州）进行估算，PCR产物之间长度≥20 bp划分为不同基因类别。

表1 用于PfMSP-1和PfMSP-2基因分型的引物序列

2.1 PfMSP-1基因分型结果

181份恶性疟疾患者的血样经巢式PCR扩增PfMSP-1基因片段，阳性结果178份（98.34%）（表2），其中K1等位株171份（94.48%），基因片段在100～320 bp，以120～200 bp的基因片段占优势地位；MAD20等位基因型175份（96.69%），基因片段在100～280 bp，以120～180 bp的等位基因片段占优势地位；RO33等位基因型126份（69.61%），基因片段在140～520 bp，以140～160 bp的基因片段占优势地位。由此可见，K1 和MAD20基因型虫株为比奥科岛的优势虫株。从表可见，大多数患者为多基因型虫株混合感染，混合感染率为97.24%。仅有1.10%（2/181）的样本为单独MAD20基因型虫株感染，未发现单独感染K1和RO33的等位基因型虫株的样本。

表2 比奥科岛恶性疟原虫PfMSP-1和PfMSP-2基因分型结果

2.2 PfMSP-2基因分型结果

181份的血样恶性疟疾患者的血样中的173份用上述等位基因特异性引物经巢式PCR扩增得到PfMSP-2基因片段（表2），属于单独3D7等位基因型感染48份（26.52%），片段长度在200～330bp，单独FC27等位基因型感染4份（2.21%），基因片段长度在330～500 bp。可见3D7型虫株为该岛优势虫株。其余121份血样同时扩增出两种不同等位基因型的基因片段，混合感染率为66.85%。

某一地区恶性疟原虫种株的基因分型及变异程度与患者的年龄、遗传特性有一定的关系，也与疟疾疫苗的效果评价密切相关[4]，因此，恶性疟原虫的基因分型是近年来国际上的研究热点。PfMSP-1和PfM SP-2作为疟原虫裂殖子表面蛋白家族中的两个重要成员，参与疟原虫裂殖子入侵红细胞的过程，同时能诱导宿主产生免疫应答效应，因此，对其进行分型研究具有重要意义。

本研究通过对中非地区赤道几内亚共和国的比奥科岛恶性疟原虫的种群进行MSP-1和MSP-2基因的分型研究，结果表明比奥科岛恶性疟原虫种群分别有26种MSP-1和42种MSP-2的等位基因型存在。这明显高于其中非邻国的报道，如Aubouy等[10]报道的加蓬存在25种PfMSP-1等位基因型和19种PfMSP-2等位基因型；Mayengue等[11]报道刚果存在15种PfMSP-1等位基因型和20种PfMSP-2等位基因型；Dolmazon等[12]报道的中非共和国（CAR）的17种PfMSP-1等位基因型和25种PfMSP-2等位基因型。

比奥科岛的恶性疟原虫种群的MSP-2基因存在两种类型，即3D7等位基因型和FC27等位基因型，它们分别扩增出22和20种基因片段。与其他中非邻国相比，3D7等位基因型在加蓬报道了8种[10]，刚果共和国的布拉柴维尔发现了10种[11]，在中非的班基发现了11种[12]。FC27等位基因分别在加蓬[10]、刚果共和国的布拉柴维尔[11]、中非的班基[12]发现了 11、10、11种，因此，赤道几内亚的PfMSP-2的多态性明显高于其他的中非国家；本研究亦发现比奥科岛恶性疟原虫种群的MSP-1的K1、MAD20和RO33基因分别有9、9和8个基因片段，K1和MAD20等位基因家族是主要的基因型，与中非的加蓬[10，13]、尼日利亚[14]、喀麦隆[15]的研究一致。

以往的疟原虫遗传多态性研究发现，全球许多地区存在很大比例的多种恶性疟原虫株、型流行，而同一地区的恶性疟原虫基因多样性及多重感染的流行程度与当地疟疾的流行水平密切相关[4]，诸如该地区的传播媒介的种群结构、人类宿主、昆虫接种率以及对抗疟药敏感性等的差异，在一定程度上对恶性疟原虫种群结构都产生了巨大影响。本研究发现了，伴随着当地PfMSP-1和PfMSP-2各等位基因的高度复杂多样性，多重感染的比例也相当之高，这个发现与以往在伊朗的报道一致[16]。该岛恶性疟原虫的PfMSP-1等位基因型的混合感染率高达97.24%，PfMSP-2等位基因型的混合感染率也高达66.85%，提示在当地建立全面监测耐药性的基础上系统地探究疟原虫种群的流行病学特征，对制定该地区疟疾预防和杀灭对策是至关重要的。同时也提醒了我们，在疟原虫分子流行病学的研究中只用一种分子标记得出的结果并不是很可靠的，研究中同时使用两种以上的分子标记可获得更加有用和准确的信息。

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Study on gene polymorphism of MSP-1 and MSP-2 of Plasmodium falciparum in Bioko Island in Equatorial Guinea

CHEN Jiang-tao1,2,3LI Jian4PAN Xue-feng3Urbano Monsuy Eyi5Rocio Apicante Matesa5Maximo Miko Ondo Obono5Carlos Sala Ehapo5ZHA Guang-cai6HUANG Guang6HUANG Zhi-xiu6LIN Min1▲
1.Department of histology and Embryology,Medical College of Shantou University in Guangdong Province,Shantou 515041,China;2.Laboratory Medicine Center,Center People′s Hospital of Huizhou City in Guangdong Province,Huizhou 516008,China;3.China′s Medical Detachment of Equatorial Guinea Guangdong Province,Guangzhou 518000,China; 4.School of Basic Medicine in Hubei Medical College,Shiyan 442000,China;5.Medical Laboratory,Malabo Regional Hospital in Equatorial Guinea,Malabo 999115,Africa;6.College of Life Science and Food Science And Technology of Hanshan Normal University in Guangdong Province,Chaozhou 521041,China

[Abstract]ObjectiveTo study the type of Plasmodium falciparum MSP-1(PfMSP-1)and PfMSP-2 gene in Bioko Island of Equatorial Guinea.Methods181 blood samples were collected from patients with malaria in Bioko Island.Microscopy and fluorescence quantitative PCR were used to identify the insect species.Nested PCR was used to amplify the specific fragment of PfMSP-1 and PfMSP-2 respectively,then the allele typing was conducted.ResultsPfMSP-1 genotypes:178 (98.34%)PfMSP-1 gene fragments were amplified from the 181 blood samples.MAD20-type,K1-type and RO33-type alleles were obtained from 171(94.48%),175(96.69%)and 126(69.61%)samples respectively.The mixed infection rate was 97.24%.PfMSP-2 genotypes:173(95.58%)PfMSP-2 gene fragments were amplified from the 181 blood samples of patients. Single 3D7-type and single FC27-type alleles were obtained in 8(26.52%)and 4(2.21%)samples respectively.The mixed infection rate was 66.85%.ConclusionPfMSP-1 and PfMSP-2 from Bioko Island are widespread.Mixed infection is the main type of malaria in Bioko Island.

[Key words]Plasmodium falciparum;Merozoite surface protein-1;Merozoite surface protein-2;Bioko Island

[中图分类号]R382.3+1

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）05（a）-0009-04

（收稿日期：2017-04-14本文编辑：许俊琴）

[基金项目]广东省自然科学基金项目（2016A030313116）▲