胡建锋1尹松梅2▲谢双锋2聂大年2李益清2

1.广东省佛山市顺德区中医院肿瘤科，广东佛山 528333；2.中山大学孙逸仙纪念医院血液科，广东广州 510120

[摘要]目的探讨丙戊酸（VPA）对耐三尖杉酯碱的HL-60细胞（HL-60/HT）耐药性的影响。方法选择递增压力培养法建立HL-60/HT细胞株。分为三组，Ara-C组、VPA组、VPA+Ara-C组，采用MTT法测定使用各组药物后敏感细胞、耐药细胞增殖情况的变化，同时测定丙戊酸对HL-60/HT细胞耐药性的改变，用流式细胞仪检测敏感的HL-60细胞及HL-60/HT细胞的细胞周期。结果丙戊酸与Ara-C合用可明显抑制HL-60、HL-60/HT细胞生长，抑制率高于丙戊酸或Ara-C单独的作用（q=1.37、1.51）。结论丙戊酸能够抑制HL-60、HL-60/HT细胞生长，可与Ara-C发挥协同作用，降低白血病细胞的耐药性。

[关键词]丙戊酸；HL-60/HT细胞；白血病

白血病的主要治疗方法是联合化疗，据统计60%～70%的患者经联合化疗后症状缓解，但短期内易复发，主要原因是白血病细胞固有或获得的多药耐药性[1-6]。本研究旨在探讨VPA对耐三尖杉酯碱（HT）的HL-60细胞（HL-60/HT细胞）耐药性的影响。

1.1 试剂与材料

RPMI1640培养基（LM-R1641/500）、二甲基亚砜（DMSO）（20161020 AR）购自博升生物公司；四氮唑蓝（MTT）（B00718301）、VPA（B 2016110402）为贝斯特试剂公司产品；胎牛血清（13011-8611）购自杭州四季青公司；淋巴细胞分离液（E501064-0001）、D-Hank液（160922-1）购自上海生工生物工程公司；HT（20161006002）、Ara-C（20161120001）为Pharmacia& Upjohn公司产品；RNA酶（160910-2）、碘化丙啶（PI）（161104-1）购自上海华联制药有限公司。HL-60细胞自中山大学药学院引进。

1.2 细胞培养及耐药株的建立

HL-60细胞接种于RPMI1640完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中，每2天换液1次，细胞4～5 d传代1次。

采用极限稀释法筛选耐药的细胞克隆，具体方法为：取处于对数增长期的HL-60细胞，用递增压力选择培养法建立HL-60/HT耐药细胞株。开始时HT的浓度为0.005 μg/ml，培养2 d后换液并洗去药物，无药物环境中培养2 d。以此浓度培养3次后，将药物浓度改为0.01 μg/ml，并逐渐加大HT浓度。5个多月后，培养出HL-60/HT耐药细胞，采用MTT法检测细胞对药物的半数抑制浓度（IC50），确认耐药细胞。

1.3 对耐药细胞和敏感细胞增殖抑制率的检测

设Ara-C作用HL-60细胞组和HL-60/HT细胞组、VPA作用HL-60细胞组和HL-60/HT细胞组、VPA+Ara-C作用HL-60细胞组和HL-60/HT细胞组，分别用MTT法分别测定Ara-C组、VPA组、VPA+ Ara-C组对HL-60/HT细胞和HL-60细胞的增殖抑制率。将重悬细胞浓度调整为1×105/ml，以每孔200 μl接种于96孔平板，置37℃、5%CO2环境中孵育24 h。然后向每孔中加Ara-C或VPA或VPA+Ara-C。两种细胞均设置无细胞培养液组和无药对照组。48 h后加入20 μl MTT（终浓度为5 g/L），继续孵育4 h，去除培养液，加DMSO 150 μl，振荡10 min混匀，以无细胞培养液组调零，用酶标仪分别测定595nm和492 nm处的吸光度值（A值）。不同条件下每次均设8个平行孔，重复3次。细胞生长抑制率=（无药对照组A值均值-实验组 A值均值）/无药对照组 A值均值× 100%。用直线回归法计算各种药物的IC50。

1.4 耐药的稳定性测定

将 HL-60/HT传代细胞在不含药物的 RPMI 1640完全培养基培养2个月，取对数生长时期的细胞，测定细胞对HT的IC50，方法同“1.3”，分析HL-60/HT细胞获得性耐药的稳定性。

1.5 流式细胞仪测细胞周期

设Ara-C作用HL-60细胞组和HL-60/HT细胞组、VPA作用HL-60细胞组和HL-60/HT细胞组、VPA+Ara-C作用HL-60细胞组和HL-60/HT细胞组，分别用流式细胞仪测定Ara-C组、VPA组、VPA+ Ara-C组对HL-60/HT细胞和HL-60细胞的细胞周期影响。用PBS缓冲液重悬待检细胞，使细胞密度调整为1×106/ml。取细胞悬液0.5 ml，加入70%冰乙醇2 ml，4℃过夜，2000×g转速离心5min后，弃去上清液，用PBS缓冲液洗涤2次，依次加入50 μl浓度为50 mg/L的RNA酶、450 μl浓度为50 mg/L的碘化丙啶（PI），37℃避光1 h，用流式细胞仪测定细胞周期。

1.6 统计学分析

所有数据均采用SPSS 12.0统计学软件处理，计量资料用±s表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。金正均q值法计算两种药物相互作用：q=E（AB）／[EA+（1-EA）×EB]，其中E（AB）表示两种药物合用时对细胞的作用，EA和EB分别为每种药物单用时的效应，q<0.85说明两药物相拮抗，q=0.85～1.15说明两药物作用相加，q>1.15说明两药物有协同作用[7-8]。

2.1 Ara-C对HL-60、HL-60/HT细胞的中位抑制浓度

Ara-C对HL-60细胞的IC50是0.20 μg/ml，对HL-60/HT细胞的IC50是0.73 μg/ml，耐药倍数3.65倍。

2.2 HL-60/HT细胞耐药稳定性

HL-60/HT子代细胞在未加VPA、Ara-C条件下培养2个月，多次传代后，测定HT的IC50值，无明显改变，表明细胞株的耐药性稳定。

2.3 Ara-C组、VPA组、VPA+Ara-C组对HL-60/HT细胞和HL-60细胞的抑制作用

Ara-C、VPA单独使用时对HL-60细胞及HL-60/HT细胞生长有抑制作用，且VPA对HL-60细胞的抑制作用明显强于HL-60/HT细胞（P＜0.05），两药联合使用时对两种细胞的生长抑制作用均强于单药的抑制效果（P＜0.05），且VPA和Ara-C联合用药对生长抑制率的影响有协同作用（q=1.37、1.51）（表1）。

表1 Ara-C组、VPA组、VPA+Ara-C组对HL-60、HL-60/HT细胞的生长抑制作用（%，n=3）

 

与同组HL-60细胞比较，*P＜0.05；与VPA+Ara-C组比较，笠P＜0.05

2.4 Ara-C组、VPA组及VPA+Ara-C组对HL-60、HL-60/HT细胞周期的影响

VPA组、VPA+Ara-C组HL-60、HL-60/HT细胞的G1期细胞含量均明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05），Ara-C组HL-60、HL-60/HT细胞G1期细胞含量无增加（P＞0.05）（表2）。

表2 Ara-C组、VPA组、VPA+Ara-C组对HL-60、HL-60/HT细胞周期的影响[G1期细胞含量[（%），n=3]

 

与本组同细胞作用前比较，*P＜0.05

HDAC可以催化蛋白质中赖氨酸残基脱乙酰基，包括核小体组蛋白的多个亚型，如H2A、H2B、H3和H4等，调节组蛋白乙酰化水平。去乙酰化组蛋白引起染色质立体构像收缩，从而抑制基因转录，而乙酰化组蛋白有更开放的构像，从而具有更高的转录活性[9-14]。杜华文等[15]研究发现VPA可以使人卵巢癌A2780细胞生长停滞在G1期，并诱导凋亡。本实验在获取耐三尖杉酯碱的HL-60/HT细胞后，进一步观察了VPA对敏感白血病细胞及耐药白血病细胞的影响。结果显示，VPA能明显抑制HL-60/HT、HL-60细胞增殖，使细胞阻滞于G1期。与Ara-C联合应用，在抑制细胞增殖方面，较各自单独应用明显增强。这可能是因为VPA抑制核小体组蛋白脱乙酰基，乙酰化的核染色质呈疏松、开放的构像，对DNA损伤有更高的敏感性，细胞更易于凋亡，因此，VPA与Ara-C联用，对HL-60、HL-60/HT细胞的生长抑制明显增强，两者具有协同效用。由此可见，VPA不仅能抑制敏感的HL-60细胞生长，而且对耐三尖杉酯碱的HL-60/HT细胞的生长也有抑制作用，并且与Ara-C有协同作用，能够降低耐药白血病细胞的耐药性，值得进一步研究。

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Impact of Valproic Acid on drug resistance of HL-60 cell

HU Jian-feng1YIN Song-mei2▲XIE Shuang-feng2NIE Da-nian2LI Yi-qing2
1.Department of Oncology,Shunde District Hospital of Traditional Chinese Medicine in Foshan City of Guangdong Province,Foshan 528333,China;2.Department of Blood,Sun Yat-sen Memorial Hospital of Zhongshan University in Guangdong Province,Guangzhou 510120,China

[Abstract]ObjectiveTo explore the impact of Valproic Acid(VPA)on drug resistance of HL-60 cells（HL-60/HT）resistant harringtonine.MethodsHL-60/HT cell strain was established by incremental pressure culture and divided into 3 groups:Ara-C group,VPA group and VPA+Ara-C group.MTT method was used to determine the change of proliferation of sensitive cells and drug resistant cells after using drug.The change of VPA resistance in HL-60/HT cells was determinated simultaneously.The cell cycle of seneitive HL-60 cells and HL-60/HT cells were detected by flow cytometry.ResultsVPA in combination with Ara-C can obviously inhibit the growth of HL-60 and HL-60/HT cell,and the inhibition rate was higher than that of VPA or Ara-C alone(q=1.37,1.51).ConclusionVPA can inhibit the growth of HL-60 and HL-60/HT cell.It can play a synergistic role with Ara-C and reduce the drug resistance of leukemia cells.

[Key words]Valproic acid;HL-60/HT cell;Leukemia

[中图分类号]R733.7

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）04（c）-0067-03

（收稿日期：2017-03-09 本文编辑：许俊琴）