钟秀茵 杨晓斌 何湘鹃 黄少霞 蔡 艺

广州市黄埔区疾病预防控制中心，广东广州 510700

[摘要]目的分析并探讨胶体金免疫层析法（GICA）检测登革热病毒NS1抗原和（或）IgG/IgM抗体的效果。方法选择我院2014年1月～2015年6月收治的1200例门诊疑似登革热病毒感染者作为研究对象，应用随机分组法将患者分为两组各600例，分别接受聚合酶链反应（PCR）荧光探针法和酶联免疫吸附测定法（ELISA），再将上述两类样本分别随机分为3份，每份200例，A组用GICA检测NSI抗原，B组用GICA检测IgG/IgM抗体，C组共同检测NS1抗原和 IgG/IgM抗体。另D组选取60名健康人群使用GICA联合检测NS1抗原和IgG/IgM抗体。结果ELISA组结果：A组结果与ELISA结果相比，阳性、阴性、总体符合率分别为82.88%、90.00%、83.00%，结果有统计学差异（P<0.05）；B组结果与ELISA结果相比，阳性、阴性、总体符合率分别为88.20%、71.79%、85.00%，结果有统计学差异（P<0.05）；C组结果与ELISA结果相比，阳性、阴性、总体符合率分别为94.87%、47.73%、84.50%，结果无统计学差异（P>0.05）；PCR组结果：A组结果与PCR结果相比，阳性、阴性、总体符合率分别为87.68%、83.87%、86.50%，结果有统计学差异；B组结果与PCR结果相比，阳性、阴性、总体符合率分别为91.45%、85.42%、90.00%，结果有统计学差异（P<0.05）；C组结果与 PCR结果相比，阳性、阴性、总体符合率分别为95.43%、60.00%、91.00%，结果无统计学差异（P>0.05）；D组结果均为阴性，特异性为100%。结论GICA对NIS抗原和IgG/IgM抗体的联合检测结果与ELISA和PCR检测结果较为接近，且特异性比较好，可用于登革热病毒感染的早期筛查和辅助诊断。

[关键词]胶体金免疫层析法；酶联免疫吸附测定法；聚合酶链反应；登革热病毒

登革热（dengue fever，DF）和登革热出血热（dengue hemorrhagic fever，DHF）是由登革热病毒（dengue virus，DV）引起的热带虫媒传染病，DV分为4个血清型（DV1、DV2、DV3、DV4），流行于全球热带和亚热带的60多个国家和地区，以东南亚国家最为严重。我国40年代在东南亚沿海曾有散发流行，至1978年在广东佛山暴发流行以来，就不断出现登革热暴发和流行。其中，2014年，广东省及广州市登革热疫情更是出现了史无前例的大爆发流行，报告病例数将近4万，引起了严重的公共卫生问题，引起国家及社会公众的高度关注，严重影响正常的社会秩序和广大群众的身体健康及日常生活。本研究主要拟采用 GICA法和ELISA法及核酸检测PCR法3种方法进行比较检测登革热病毒，对3种常用的检测方法的实验条件进行摸索和优化，分析每种方法的优缺点和适用范围以及其各自的灵敏度和特异性等，结合疫情选择合适的检测方法，必要时联合使用，使得实验室诊断结果既快速准确，又科学高效[1-6]，现报道如下。

1.1 一般资料

选取我院 2014年 1月～2015年 6月收治的1200例门诊疑似登革热病毒感染者作为研究对象，年龄16～60岁，平均35.8岁；男723例，女477例；文化水平：小学及以下414例，中学456例，大学及以上330例；排除有既往病史，药物过敏史者。将患者随机分为PCR组和ELISA组，各600例，分别采用PCR和ELISA检测。对两组患者进行再次分组，分别分为A、B、C三组，各200例。另选60名健康人群作为对照（D组），各组患者的年龄、性别、文化程度等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有实验流程均详情告知参与研究者并签署知情同意书，本实验经本院医学伦理委员会批准。

1.2 检测方法

PCR组和ELISA组患者分别接受PCR荧光探针法和ELISA，PCR反应条件：42℃8 min，95℃10 s，95℃5 s，60℃34 s，45个循环；退火温度按55～60℃间隔1℃分别试验优化，退火温度为60℃时，反应曲线呈典型的S型，荧光信号最强，本实验选择60℃作为退火温度进行下面的所有荧光PCR反应；ELISA采用间接法。A组用GICA检测NSI抗原，B组用GICA检测IgG/IgM抗体，C组共同检测NS1抗原和IgG/IgM抗体，D组使用GICA联合检测NS1抗原和IgG/IgM抗体。所有检测指标均以检出抗原或抗体为阳性，未检出为阴性。其中DENV核酸试剂由江苏硕世生物有限公司提供；ELISA试剂盒由澳大利亚PanBio公司提供；DENV NS1抗原和或IgG/IgM抗体检测试剂由澳大利亚PanBio公司提供。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，计量资料组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 ELISA组中A组检测结果

DENV NS1抗原检测与ELISA的阳性符合率为82.88%，阴性符合率为90.00%，总体符合率为83.00%，NS1抗原检测结果与ELISA检测结果比较，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

表1 A组ELISA检测和NS1抗原检测结果的比较（例）

2.2 ELISA组中B组检测结果

IgG/IgM抗体检测与 ELISA的阳性符合率为88.20%，阴性符合率为71.79%，总体符合率为85.00%，IgG/IgM抗体检测结果与ELISA检测结果比较,差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

表2 B组ELISA检测和IgG/IgM抗体检测结果的比较（例）

2.3 ELISA组中C组检测结果

DENV NS1抗原检测联合IgG/IgM抗体检测与ELISA的阳性符合率为94.87%，阴性符合率为47.73%，总体符合率为84.50%，NS1抗原检测联合IgG/IgM抗体检测与ELISA检测结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3 C组ELISA检测和联合NS1抗原检测和IgG/IgM抗体结果的比较（例）

2.4 PCR组中A组检测结果

DENV NS1抗原检测与PCR的阳性符合率为87.68%，阴性符合率为83.87%，总体符合率为86.50%，NS1抗原检测结果与PCR检测结果比较，差异有统计学意义（P<0.05）（表4）。

表4 A组PCR检测和NS1抗原检测结果的比较（例）

2.5 PCR组中B组检测结果

IgG/IgM抗体检测与 PCR的阳性符合率为91.45%，阴性符合率为85.42%，总体符合率为90.00%，IgG/IgM抗体检测结果与PCR检测结果比较，差异有统计学意义（P<0.05）（表5）。

表5 B组PCR检测和IgG/IgM抗体检测结果的比较（例）

2.6 PCR组中C组检测结果

DENV NS1抗原检测联合IgG/IgM抗体检测与PCR的阳性符合率为95.43%，阴性符合率为60.00%，总体符合率为91.00%，NS1抗原检测联合IgG/IgM抗体检测与PCR检测结果比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表6）。

表6 C组PCR检测联合NS1抗原检测和IgG/IgM抗体检测结果的比较（例）

2.7 D组检测结果

采用GICA联合检测NS1抗原及IgG/IgM抗体，所得结果均为阴性，说明检测特异性为100%，具有高特异性。

常用于登革热抗体检测的方法主要有血凝抑制试验（HAI）、间接免疫荧光法（IFA）、ELISA法、免疫斑点法（DIBA）、胶体金免疫层析法（GICA）及核酸检测PCR法等[7-11]。其中，HAI法虽然是WHO推荐的方法，但是由于其试剂和试验操作不易标准化，操作繁琐、检测周期长，在基层实验室难以开展；IFA法操作条件难以控制，非特异性反应较高，交叉反应明显，易出现假阳性，也难在基层医疗机构建立。由于登革热疫苗研究尚未取得突破性进展，因此，登革热病毒进行快速检测和分型对登革热的临床诊断和综合防治有重要意义。然而，在2014年疫情暴发之前，广州市各区疾控中心及相关医疗机构在登革热病毒实验室诊断方面仍缺乏检验经验，方法不完善，因此建立有效的适合基层实验室的检测方法极其重要和迫切[12-14]。

本研究主要探索登革热病毒检测的实验室诊断方法，采用GICA、ELISA法及核酸检测PCR法3种方法检测登革热病毒，结合登革热疫情的流行病学资料，为基层实验室应对登革热疫情提供检测方法的参考和依据。分析检测结果，PCR技术应用于登革热病毒的检测极大提高了检测速度，重复性好，特异性高，可快速分型，为登革热的临床诊断提供了一种有效的手段[15]，但由于PCR技术含量高，费用昂贵，不适合基层实验室。ELISA法检测DV-IgM/IgG抗体敏感性和特异性较高，对检测设备条件要求低，但检测时间较长，适合爆发流行期间大批量标本检测。GICA在联合检测NS1抗原和IgG/IgM时与ELISA法和PCR检测结果相近，有理想的敏感性和特异性，无需特殊的仪器设备，检测手段简单，能快速出结果，适合于临床的推广应用。

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Clinical significance of GICA in detection of Dengue virus NS1 antigen and/or IgG/IgM antibody

ZHONG Xiu-yin YANG Xiao-bin HE Xiang-juan HUANG Shao-xia CAI Yi
Center for Disease Control and Prevention of Huangpu District in Guangdong Province,Guangzhou 510700,China

[Abstract]ObjectiveTo analyze and explore the effect of application of colloidal gold immunochromatography assay (GICA)in the detection of Dengue virus NS1 antigen and/or IgG/IgM antibody.MethodsAltogether 1200 cases of suspected Dengue virus infection patients who were treated in our hospital from January 2014 to June 2015 were involved as the object of this research and divided into two groups(PCR group and ELISA group)by using the random grouping method,with 600 casesin each group.Two groups were treated with polymerase chain reaction(PCR)fluorescence probe and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),respectively.The two types of samples aforementioned were randomly divided into 3 sub-groups,with 200 samples in each sub-groups:GICA was used in group A to detect NSI antigen;GICA was used in group B to detect IgG/IgM antibody;it was also used in group C for detection of NS1 antigen and IgG/IgM antibody.Additionally,60 healthy volunteers were selected as Group D,whose NS1 antigen and IgG/IgM antibody were detected by using GICA.ResultsELISA group results:compared with the results of ELISA group,the positive,negative and overall coincidence rate of group A were 82.88%,90.00%and 83.00%,with statistically significant difference(P<0.05);compared with the results of ELISA group,the positive,negative and overall coincidence rate of group B were 88.20%,71.79%and 85.00%,with statistically significant difference(P<0.05);compared with the results of ELISA Group,the positive,negative and overall coincidence rate of group A were 94.87%,47.73%and 84.50%,without statistically significant difference(P>0.05);PCR group results:compared with the results of PCR group,the positive,negative and overall coincidence rate of group A were 87.68%,83.87% and 86.50%,with statistically significant differenc(P< 0.05);compared with the results of PCR group,the positive,negative and overall coincidence rate of groupB were 91.45%,85.42%and 90%,with statistically significant difference(P<0.05);compared with the results of PCR Group,the positive,negative and overall coincidence rate of Group B were 95.43%,60.00%and 91.00%,without statistically significant difference(P>0.05).The result of Group D was negative and its specificity was 100%.ConclusionThe result achieved by application of GICA is close to that of ELISA and PCR in detection of NIS and IgG/IgM with good specificity.tcan be used for early screening and diagnosis of dengue virus infections.

[Key words]Colloidal gold immunochromatographic assay;Enzyme-linked immunosorbent assay;Polymerase chain reaction;Dengue virus

[中图分类号]R512.82

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）04（c）-0156-04

（收稿日期：2016-12-29 本文编辑：马 越）

[基金项目]广东省广州市黄埔区科技计划项目（201544-17）

[作者简介]钟秀茵（1972-），女，硕士，副主任技师，主要从事卫生检验工作