夏文燕 许 荣 方向南 秦永章 欧阳龙强▲

赣南医学院第一附属医院内分泌科，江西赣州 341300

[摘要]目的探讨吡格列酮和高糖对3T3-L1细胞中p-Perilipin 1A蛋白表达的影响。方法将以3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成3T3-L1脂肪细胞，进行分组，设对照组（5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖）、高糖加吡格列酮组（25 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L吡格列酮），通过测定培养基中甘油含量作为评价脂肪分解的指标，同时用Western blot检测p-Perilipin 1A蛋白表达。结果通过甘油试剂盒监测甘油释放量，高糖组较对照组明显增加，差异有统计学意义（P<0.01），而高糖加吡格列酮组的甘油释放量较高糖组明显减少，差异有统计学意义（P< 0.01）；同时Western blot检测结果显示，与对照组比较，高糖组p-Perilipin 1A蛋白明显上调，差异有统计学意义（P<0.01），高糖组与高糖加吡格列酮组比较，显著抑制了p-Perilipin 1A蛋白的上调，差异有统计学意义（P<0.01）。结论吡格列酮可能通过阻止p-Perilipin 1A上调来抑制高糖刺激下的脂肪分解，减少游离脂肪酸，从而改善胰岛素抵抗。

[关键词]吡格列酮；高糖；3T3-L1细胞；p-Perilipin 1A

目前代谢综合征的发病率正以惊人的速度上升[1]，脂代谢紊乱是代谢综合征的病理特点，因为在血循环中增加了源自脂肪组织的非酯化游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）[2]。这些FFA可以引发肌肉、肝脏处胰岛素抵抗[3]。FFA的浓度主要由脂肪细胞的脂肪分解控制。周脂素（PLIN1，Perilipin 1A）能双重调控脂类代谢[4]，Perilipin 1A表达下降和磷酸化上调都能促进脂解，诱发胰岛素抵抗[5]。目前，研究已明确噻唑烷二酮类诱导调节糖、脂代谢的相关蛋白表达而减轻胰岛素抵抗[6]，但是如何调节脂代谢的相关蛋白表达以改善胰岛素抵抗作用的研究尚不多。而本文旨在研究吡格列酮在3T3-L1细胞是否可通过抑制高糖刺激下的脂滴包被蛋白p-Perilipin1A蛋白的表达上调来减少脂肪分解进一步减少FFA，以助于减轻胰岛素抵抗。

1.1 主要试剂

3T3-L1前脂肪细胞株（美国模式培养物集存库提供）、葡萄糖（北京益利精细化学品有限公司）、地塞米松（D4902）、1-甲基-3-异丁基-黄嘌（I5879）、无酚红DMEM培养基（美国Sigmag公司）、胰蛋白酶、5 mmol/L无酚红葡萄糖（DMEM）培养基（美国Gibco公司）、兔抗牛p-Perilipin 1A抗体（北京博奥森生物技术公司）、胰岛素（诺和诺德公司）、吡格列酮（原料，纯度99.3%，江苏涟水制药有限公司）、胎牛血清（美国PAA公司）、甘油检测试剂盒（上海超研生物科技有限公司）、Western blot试剂盒（上海经科化学科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪细胞的培养和诱导分化 3T3-L1前脂肪细胞以含10%胎牛血清（DMEM）培养基，在室温、体积分数为0.07的CO2的条件下培养。细胞融合率为80%～90%时，行传代接种。细胞融合后，加含诱导液（地塞米松、胰岛素、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤）的DMEM培养液再孵育2 d；然后以含10 μg/ml胰岛素的DMEM培养液孵育2 d，随后以DMEM培养液继续孵育6 d，3T3-L1细胞在诱导分化约10 d 90%呈脂肪细胞表型[7]。

1.2.2 3T3-L1脂肪细胞分组 将3T3-L1脂肪细胞分为三组：对照组（5 mmol/L葡萄糖）（第1组）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖）（第2组）、高糖+吡格列酮组（25 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L吡格列酮）（第3组）。每组细胞以5 mmol/L葡萄糖培养基培养同步化12 h后，第3组无血清培液中加入吡格列酮，摸索浓度（0、20、40、60、80、100 μmol/L）达终浓度100 μmol/L，预处理3 h后，第2组和第3组中加入葡萄糖，终浓度25 mmol/L，温育24 h。

1.2.3 3T3-L1脂肪细胞脂肪分解的测定 将脂肪细胞进行分组，衡量脂肪细胞分解的指标是以孵育后测定培养基中甘油累积量。将细胞孵育一定时间后用GPO-POD酶法直接测定培养基中甘油含量作为累积值。具体在酶标板中每组各设置5个孔，将50 μl无酚红DMEM培养液中加入150 μl工作液中，室温静置15 min，于光密度550波长处比色[8]。绘制曲线计算甘油浓度。

1.2.4 Western blot检测p-Perilipin 1A蛋白的表达 将总蛋白样品用SDS-PAGE电泳进行分离，并转移至PVDF膜，常温下以5%脱脂奶粉封闭，加入p-Perilipin 1A多克隆抗体孵育12 h以上，洗涤后，加入辣根过氧化酶（HRP）标记的Ⅱ抗室温孵育1 h，再洗涤，ECL显影剂显影，以激光扫描仪进行定量扫描。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 吡格列酮对高糖诱发的3T3-L1脂肪细胞脂肪分解的影响

第2组的甘油量比第1组高，差异有统计学意义（P<0.01），第3组较第2组甘油释放量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01），而第1组和第3组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图1）。

 

图1 高糖在3T3-L1脂肪细胞中刺激脂肪分解及吡格列酮的抑制效应

2.2 吡格列酮对p-Perilipin 1A蛋白表达的影响

结果显示，第2组中p-Perilipin 1A蛋白的表达明显增加，与第1组比较，差异有统计学意义 （P< 0.01）；第3组与第2组比较，差异有统计学意义（P< 0.01），而与第1组比较，差异无统计学意义（P>0.05），光密度扫描图和分析见图2。

 

图2 高糖及吡格列酮对p-Perilipin 1A蛋白表达的影响

A.Western blot法检测的各组p-Perilipin 1A蛋白表达情况；B.*P<0.01

代谢综合征是一组复杂的代谢紊乱群，包括脂代谢紊乱，与心血管疾病的发生发展密切相关[9]，还与其他一系列疾病的发生率和死亡率密切相关。有效地封存脂肪可以防止肌肉和肝脏中脂肪酸过度，而破坏代谢综合征发生的信号途径[10]。Perilipin 1A是属于最早发现的脂滴相关蛋白PAT家族，参与脂肪细胞内三酰甘油的合成与分解，对糖脂代谢平衡起着关键作用[11]。在正常生理条件下，由儿茶酚胺通过提高细胞内的cAMP浓度并激活cAMP依赖的蛋白激酶PKA，磷酸化p-Perilipin 1A，引发脂解[12]，且 Perilipin的磷酸化是脂解的关键[13]，由此产生适量FFA为机体供能，保持脂代谢平衡。代谢综合征患者的FFA升高，原因之一，Perilipin 1A的表达减少和磷酸化的Perilipin 1A增加，低水平的Perilipin 1A和高水平的p-Perilipin 1A与高脂解率相关[14]。代谢综合征患者内源性刺激脂解因子的分泌水平增加，如炎症因子TNF-a、IL-6的分泌等。而最近几年人们已发现存在多种抑制剂可以对这些内源性刺激脂解的因子及其信号通路进行抑制，逆转Perilipin 1A的改变，减少脂解。如罗格列酮和橘皮素可以抑制NF-kB的信号通路，柚皮素可以抑制IL-6的转录，并能抑制TNF-a和IL-6介导Perilipin 1A的下调[15]。目前高血糖对Perilipin 1A磷酸化的影响研究非常少，而高血糖是代谢综合征的组成部分，因此本研究选择了以高糖作为刺激脂肪分解的因子，研究发现，3T3-L1脂肪细胞在高糖刺激下，高糖组的甘油释放量明显较对照组升高，根据Western blot法检测p-Perilipin 1A蛋白表达的数据显示，同时高糖组的p-Perilipin1A蛋白较对照组增加，并有统计学意义，因此本研究显示高浓度葡萄糖（25 mmol/L）可以提高Perilipin 1A的磷酸化水平，与Zhang等[16]的研究结果一致，其研究结果显示，主要信号通路可能包括持续激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和磷脂酶C（PLC），随之下游信号蛋白激酶C（PKC）、丝苏氨酸蛋白激酶（AKT）、丝裂原活化蛋白激酶/胞外调节号1/2（MAPK/ERK1/2）和胞浆型磷脂酶A2（cPLA2）激活而调节。

在降血糖的药物中，噻唑烷二酮类药物吡格列酮，对改善胰岛素抵抗有着显著的效能[17]。吡格列酮是PPARγ激动剂。已有研究表明PPARγ这个转录因子与代谢紊乱的调节密切相关，吡格列酮可通过PPARγ通路调节多种信号因子，影响3T3-L1细胞脂肪形成[18]，故推测吡格列酮是否可以逆转Perilipin 1A磷酸化的改变，减少脂解。本研究通过测定甘油释放量，吡格列酮预处理后，可以抑制高糖引发的脂肪分解，脂肪分解率明显降低，与高糖组比较，差异有统计学意义。同时根据Western blot法检测p-Perilipin 1A蛋白表达的数据显示，发现p-Perilipin1A蛋白表达下调，说明吡格列酮可以抑制高糖刺激的p-Perilipin1A蛋白的上调，进一步阐述了高糖刺激下，吡格列酮仍可以通过减少Perilipin1A的磷酸化，减少脂肪分解，则最终可以改善胰岛素抵抗。

综上所述，在代谢综合征患病率急速上升的趋势下，需要寻找有效的药物来控制各项代谢危险因素，本研究发现p-Perilipin 1A蛋白可作为一治疗靶点，调控细胞的脂肪分解，改善胰岛素抵抗，同时发现吡格列酮药物可以有效抑制Perilipin1A的磷酸化，减少脂肪分解，但具体调控机制还有待进一步研究。

[1]Kriksciuniene R，Zilaitiene B，Verkauskiene R.The current management of turner syndrome[J].Minerva Endocrinol，2016，41（1）：105-121.

[2]Boden G.Does inhibition of β-cell proliferation by free fatty acid in mice explain the progressive failure of insulin secretion in type 2 diabetes?[J].Diabetes，2012，61（3）：560-561.

[3]Velk J，VejrakovD，VakovM，et al.T2D risk haplotypes of the TCF7L2 gene in the Czech population sample：the association with free fatty acids composition[J].Physiol Res，2012，61（3）：229.

[4]Kimmel AR，Sztalryd C.The perilipins：major cytosolic lipid droplet-associated proteins and their roles in cellular lipid storage，mobilization，and systemic homeostasis[J].Annual Review of Nutrition，2016，36（1）：471.

[5]Miyoshi H，Souza SC，Zhang HH，et al.Perilipin promotes hormone-sensitivelipase-mediatedadipocytelipolysisviaphosphorylation-dependent and-independent mechanisms[J].J Biol Chem，2006，281（23）：15 837.

[6]Chen HH，Horng MH，Yeh SY，et al.Glycemic control with Thiazolidinedione is associated with fracture of T2DM Patients[J].Plos One，2015，10（8）：e0135530.

[7]王丽静，张尉，刘小莺，等.地塞米松诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立[J].福建医科大学学报，2007，41（3）：282-284.

[8]夏文燕，王丽静，刘小莺，等.牛黄熊脱氧胆酸抑制TNF-α刺激3T3-L1细胞脂肪分解[J].第三军医大学学报，2012，34（12）：1206-1209.

[9]Bibra HV，Strhle A，Sutton MSJ，et al.Dietary therapy in heart failure with preserved ejection fraction and/or left ventricular diastolic dysfunction in patients with metabolic syndrome[J].Int J Cardiol，2017，234：7-15.

[10]Adams-Huet B，Devaraj S，Siegel D，et al.Increased adipose tissue insulin resistance in metabolic syndrome：relationship to circulating adipokines[J].Metab Syndr Relat Disord，2014，12（10）：503-507.

[11]Westhoff CC，Mrozinski J，Riedel I，et al.Perilipin 1 is a highly specific marker for adipocytic differentiation in sarcomas with intermediate sensitivity[J].J Cancer Res Clin Oncol，2017，143（2）：225-232.

[12]Mcdonough PM，Maciejewski-Lenoir D，Hartig SM，et al. Differential phosphorylation of perilipin 1A at the initiation of lipolysis revealed by novel monoclonal antibodies and high content analysis[J].PloS One，2013，8（2）：e55511.

[13]Elkins DA，Spurlock DM.Phosphorylation of perilipin is associated with indicators of lipolysis in Holstein cows[J]. Horm Metab Res，2009，41（10）：736-740.

[14]Mulumba M，Granata R，Marleau S，et al.QRFP-43 inhibits lipolysis by preventing ligand-induced complex formation between perilipin A，caveolin-1，the catalytic subunit of protein kinase and hormone-sensitive lipase in 3T3-L1 adipocytes[J].Biochim Biophys Acta，2015，1851（5）：657-666.

[15]Yoshida H，Takamura N，Shuto T，et al.The citrus flavonoids hesperetinandnaringeninblockthelipolyticactionsofTNF-α in mouse adipocytes[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，394（3）：728-732.

[16]Zhang TT，Xu C，Zu LX，et al.The mechanisms of stimulated lipolysis by high concentration of glucose in primary rat adipocytes][J].Beijing Da Xue Xue Bao，2008，40（3）：273-279.

[17]Gillies PS，Dunn CJ.Pioglitazone[J].Drugs，2000，60（2）：333-343.

[18]Rosen ED，Walkey CJ，Puigserver P，et al.Transcriptional regulation of adipogenesis[J].Genes&Development，2000，14（11）：1293-1307.

Effect of Pioglitazone and high glucose on the expression of p-Perilipin 1A protein in 3T3-L1 cells

XIA Wen-yan XU Rong FANG Xiang-nan QIN Yong-zhang OUYANG Long-qiang▲
Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College,Jiangxi Province,Ganzhou 341300,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of pioglitazone and high glucose on the expression of p-Perilipin 1A protein in 3T3-L1 cells.Methods3T3-L1 preadipocytes were induced and differentiated into 3T3-L1 adipocytes and then were classified into three groups：control group(5 mmol/L glucose),high glucose group(25 mmol/L glucose)and high glucose plus Pioglitazone group (25 mmol/L glucose+100 μmol/L Pioglitazone).The glycerol content of culture medium was determined and taken as the evaluation index of lipolysis;at the same time,Western blot was used to detect the expression of p-Perilipin 1A protein.ResultsAccording to the release amount of glycerol monitored by using the glycerol kit,a more obvious increase was seen in high glucose group than in control group,with statistically significant difference(P<0.01);while,a more obvious decrease of the release amount of glycerol occurred in high glucose plus Pioglitazone group than that in high glucose group,with statistically significant difference (P<0.01);at the same time,the p-Perilipin 1A proteinof high glucose group detected by Western blot was significantly increased in comparison with control group, with statistically significant difference(P<0.01);and the expression of p-Perilipin 1A protein was significantly inhibited in high glucose group in contrast with high glucose plus pioglitazone group,with statistically significant difference (P< 0.01).ConclusionPioglitazone may prevent the up-regulation of p-Perilipin 1A to inhibit glucose-stimulated lipolysis and decrease free fatty acids,thereby improving the insulin resistance.

[Key words]Pioglitazone;High glucose;3T3-L1 cells;p-Perilipin 1A

[中图分类号]R589.2

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）04（c）-0009-04

（收稿日期：2017-02-16 本文编辑：任 念）

[基金项目]江西省赣州市指导性科技计划项目（GZ2016ZSF061）