张金梅1康文全1靳广毅2陈婷婷2，3▲

1.深圳市南山区人民医院消化内科，广东深圳 518052；2.深圳大学医学院药学系，广东深圳 518060；3.深圳市人民医院暨南大学第二临床医学院心内科，广东深圳 518020

[摘要]目的初步探讨神经系统药物对胃肠道肿瘤的作用。方法选取硫利达嗪、氯雷他定、东莨菪碱、多巴胺、乙酰胆碱、舒乐安定6种经典的神经系统药物，利用CCK-8法，从0.01、0.1、1、10、100 μmol/L不同浓度梯度分别检测其对胃肠道肿瘤体外的活性。并以小鼠脾脏淋巴细胞为模型，研究神经系统药物在体外对免疫细胞的安全性。结果6种经典的神经系统药物中，100 μmol/L东莨菪碱、100 μmol/L氯雷他定和10 μmol/L硫利达嗪对人结肠癌和人胃癌细胞产生毒性（均P<0.05），并且以硫利达嗪和氯雷他定的组合最为有效。6种神经系统药物仅对肿瘤细胞起到杀伤的作用，而对正常小鼠的脾淋巴细胞无毒性。10 μmol/L硫利达嗪联合25 μmol/L氯雷他定体外抑制鼠源结肠癌细胞和鼠源胃癌细胞。结论硫利达嗪联合氯雷他定在体外可以有效地提高抗胃肠道肿瘤作用，为进一步联合治疗提供新策略。

[关键词]硫利达嗪；氯雷他定；神经系统药物；胃肠道肿瘤；联合治疗

中国肿瘤登记中心发布的《2013年中国肿瘤登记年报》数据显示，我国死亡率最高的7种癌症中与消化系统有关的癌症就占了5种：肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌和胰腺癌。因此，认识及研究消化系统癌症的发病机制，提高肿瘤的诊疗技术刻不容缓。传统的治疗方法有手术、化疗、放疗，但是这些方法常常无法消除所有的肿瘤细胞，有效率低。因此，联合药物肿瘤疗法可能为胃肠道肿瘤的治疗提供一种新的视角[1]。

2015年1月20日，美国临床肿瘤学会（ASCO）发布了《ASCO年度报告：2015临床肿瘤学进展》，在“十年回顾”中提到肿瘤患者的生存和存活质量在过去的十年内明显改善，其中就有1项发现是联合治疗策略有效地延长脑肿瘤和前列腺癌患者的生存期[2]。由于肿瘤高度的异质性、多样性不仅存在于不同的肿瘤和不同的患者之间，也存在于同一个肿瘤内。所以，单一的治疗方法已经很难同时克服肿瘤的异质性和各类免疫抑制机制。从神经系统药物本身的神经保护效应来看，一线化疗药物联合神经药物治疗胃肠道肿瘤，可以防止化疗药对患者神经的毒性，促使药效更趋向于安全的方向发展。目前国际上提出许多联合治疗方案，但是，神经系统药物联合治疗提高抗肿瘤的疗法，作为治疗胃肠道肿瘤的一种新的治疗策略尚未见报道。因此，利用神经系统药物调控消化系统癌症在治疗恶性肿瘤方面具有理论创新意义。鉴于以上研究进展，本课题选取了神经系统中几个经典的药物，通过检测其对胃肠道肿瘤体外的活性，从而为胃肠道肿瘤治疗的发展提供新策略。

1.1 对象

实验用Balb/c雌性小鼠，体重（16±20）g，4～6周龄，购自广东省医学动物实验中心。人结肠癌细胞（HCT116）、小鼠结肠癌细胞（CT26.WT）和人胃癌细胞（SGC7901）、小鼠胃癌细胞（MFC）均购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。其他主要实验试剂见表1。

表1 主要试剂

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人结肠癌细胞（HCT116）、小鼠结肠癌细胞（CT26.WT）和人胃癌细胞（SGC7901）、小鼠胃癌细胞（MFC）均用含10%胎牛血清、青霉素（100 μg/ml）和链霉素（100 μg/ml）的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，实验所用的细胞处于对数生长期。

1.2.2 CCK-8分析 在96孔板中配制100 μl的细胞悬液，每孔约1×104个细胞，将培养板在培养箱预培养24 h（37℃，5%CO2），向培养板加入不同浓度的多巴胺（Dopamine）、硫利达嗪（Thioridazine）、氯雷他定（Loratadine）、乙酰胆碱 （Acetylcholine）、东莨菪碱（Scopolamine）、舒乐安定（Estazolamum）单药，或者这6种神经系统药物2、3种药物联合，处理24 h之后，向每孔加入10 μl的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育1～4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.2.3 检测神经系统药物对人结肠癌（HCT116）和人胃癌（SGC7901）细胞增殖及细胞活率的影响 选取不同浓度（0.01、0.1、1、10、100 μmol/L）多巴胺、硫利达嗪、氯雷他定、乙酰胆碱、东莨菪碱、舒乐安定，利用CCK-8检测试剂分别检测对人结肠癌（HCT116）和人胃癌细胞（SGC7901）增殖及细胞活率的影响。

1.2.4 检测神经系统药物对小鼠免疫细胞活率的影响

1.2.5 硫利达嗪、氯雷他定、舒乐安定、东莨菪碱4种药物不同排列组合 硫利达嗪、氯雷他定、东莨菪碱、舒乐安定4种药物进行一系列不同组合 （表2），每种药物10 μmol/L。利用CCK-8检测试剂分别检测不同组合的神经系统药物对人结肠癌和人胃癌细胞活率的影响。

表2 四种药物不同排列组合

1.2.6 观察两种药物联合使用的协同作用 采用联合作用指数（CI）判断两种药物的协同性，CI=AB/（A×B），A、B代表两种不同药物的吸光度。CI<1为协同作用；CI=1为叠加效应；CI>1为拮抗作用。

1.3 统计学方法

采用Graphpad Prism 5软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 神经系统药物对体外胃肠道肿瘤细胞活率的影响

利用 CCK-8分别检测不同浓度（0.01、0.1、1、10、100 μmol/L）多巴胺、硫利达嗪、氯雷他定、乙酰胆碱、东莨菪碱、舒乐安定这 6种神经系统药物对人结肠癌（HCT116）和人胃癌（SGC7901）细胞增殖及细胞活率的影响。实验结果如图1所示，多巴胺、乙酰胆碱和舒乐安定与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），东莨菪碱和氯雷他定从100 μmol/L开始显著抑制肿瘤细胞的活率（P<0.01），硫利达嗪从10 μmol/L开始对肿瘤细胞产生毒性（P<0.01）（图 1）。

 

图1 神经系统药物对人结肠癌和胃癌细胞活率的影响

与对照（0 μmol/L）比较，**P<0.01

2.2 神经系统药物对小鼠免疫细胞活率的影响

以小鼠脾脏淋巴细胞为模型，研究神经系统药物在体外对免疫细胞的安全性，结果发现6种神经系统药物对小鼠脾淋巴细胞的活率基本无影响，并且100 μmol/L的多巴胺或东莨菪碱可以促进淋巴细胞的增殖（P< 0.01）（图2）。提示神经系统药物仅对肿瘤细胞起到杀伤的作用，而对正常小鼠的脾淋巴细胞无毒性。

 

图2 神经系统药物对小鼠脾淋巴细胞活率的影响

与对照（0 μmol/L）比较，**P<0.01

2.3 神经系统药物联合作用对胃肠道肿瘤细胞活率的影响

选取对人结肠癌细胞活率和人胃癌细胞活率产生抑制作用的硫利达嗪、氯雷他定、东莨菪碱这3种药物与无肿瘤细胞活率抑制作用的舒乐安定进行一系列不同组合，每种药物10 μmol/L，作用于人结肠癌（HCT116）细胞和人胃癌（SGC7901）细胞。结果发现，凡是有硫利达嗪参与的组合（Group 1、2、3、5、7、9）都会显著抑制肿瘤细胞的活率（P<0.01），并且以Group 9的硫利达嗪和氯雷他定的组合最为有效（图3）。

 

图3 神经系统药物联合作用对结肠癌和胃癌细胞活率的影响

与Con比较，**P<0.01

2.4 硫利达嗪和氯雷他定联合抗肿瘤作用

利用鼠源的结肠癌细胞（CT26.WT）和鼠源胃癌细胞（MFC），将硫利达嗪（THZ）和氯雷他定（LOR）的研究浓度进一步缩小范围，分别为1、5、10、25、50、75 μmol/L。在给药24 h之后，利用CCK-8检测试剂检测到，两种药物抑制肿瘤的活率呈浓度梯度的方式，并且硫利达嗪从10 μmol/L开始显著抑制肿瘤生长（P<0.01）；氯雷他定从25 μmol/L开始抑制人结肠癌细胞（HCT116）生长（P<0.01），50 μmol/L开始显著抑制人结肠癌细胞生长（P<0.01）；氯雷他定从50 μmol/L开始显著抑制人胃癌细胞（MFC）生长（P<0.01）（图4）。

为了进一步明确硫利达嗪和氯雷他定潜在的联合抗肿瘤效应，将10 μmol/L硫利达嗪分别与25、50、75 μmol/L氯雷他定进行不同的组合（图4），利用CI指数公式，可以得出，10 μmol/L硫利达嗪与25 μmol/L氯雷他定联用的组合，CI<1（小鼠结肠癌细胞CT26.WT CI= 0.78；小鼠胃癌细胞MFC CI=0.55），呈协同作用，为最适组合浓度。

多巴胺是儿茶酚胺类家族重要的神经递质，主要在中枢神经系统和胃肠道内合成[3]，通过靶向细胞表面特异的受体而行使它的主要功能。多巴胺受体广泛分布于大脑、心脏、肾脏、血管、肾上腺皮质以及交感神经末端。它包含5个亚型，分为两大类：一个是D1样受体（D1R，D1和D5），一个是D2样受体（D2R，D2、D3和D4），都隶属于G蛋白偶联受体的超级家族。多巴胺两种类型的受体具有相似的序列，但是拥有不同的药理学特性，D1样受体激活后升高细胞内cAMP水平，而D2样受体家族激活后降低细胞内cAMP水平[4]。越来越多的研究表明多巴胺可以通过抑制肿瘤内皮细胞上的血管表皮生长因子（VEGF-R2）的磷酸化活性，从而遏制肿瘤组织血管的生长而用于调控肿瘤的发展[5]。并且多巴胺通过激活D2样受体而抑制肿瘤细胞的生长[6-7]。D2R敲除的小鼠表现出血管生成增多、肿瘤生长以及VEGF-R2磷酸化[8]。在乳腺癌以及结肠癌细胞模型中，D2R激动剂增强抗癌药物的有效性，但是多巴胺本身并没有抑制乳腺癌及结肠癌的细胞增殖和转移[9]。许多研究将多巴胺与广谱的抗癌药阿霉素联合来治疗乳腺癌，成功降低了肿瘤的体积，增加了生存期[9]。同样在人的结肠癌中，多巴胺联合5-氟尿嘧啶也观察到类似的结果。研究表明，多巴胺通过DRD1受体来抑制CD4+和CD8+的T细胞的增殖和毒性[10]，DRD1拮抗剂SCH23390阻断DRD1受体通路后，小鼠淋巴细胞IL-4表达降低、IFN-γ表达增高[11]，并且抑制了肿瘤的生长和微管的密度[12]。

 

图4 硫利达嗪联合氯雷他定药物联合抗结肠癌和胃癌作用

与0 μmol比较，***P<0.01

硫利达嗪通过靶向大脑中的多巴胺受体，来治疗精神类疾病。2012年Cell杂志上公布，硫利达嗪通过靶向DRD2受体，成功消灭了人体的癌症干细胞以及白血病细胞，而不会对正常的细胞产生副作用[13]。

抗组胺剂或对某些肿瘤的癌症具有抗癌功效。氯雷他定主要治疗缓解过敏性皮肤病或过敏性鼻炎等症状及体征。通过拮抗H1受体，对中枢神经系统有抑制和麻醉的作用，所以也用于辅助治疗某些精神病。有研究表明氯雷他定的活性代谢物地氯雷他定可以通过抑制STAT3和c-Myc的活性而诱导皮肤T细胞淋巴瘤的凋亡[14]。同样该拮抗剂也在肿瘤肥大细胞[15]、在结肠癌中通过激活Chk1增加细胞周期中的G2/M期抑制肿瘤生长[16]。

乙酰胆碱在维持意识的清醒、学习记忆认知等活动中起到重要作用。研究利用α7型烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂可以防止肺癌的发生发展[17]。但是关于乙酰胆碱受体拮抗剂东莨菪碱作用于胃肠道肿瘤的报道极为少见。

在本研究中，选取了多巴胺、硫利达嗪、氯雷他定、乙酰胆碱、东莨菪碱、舒乐安定这6种经典的神经系统药物分别检测体外对人结肠癌（HCT116）和人胃癌（SGC7901）细胞增殖及活率的影响，并且检测对小鼠脾淋巴细胞活率的影响，结果发现这6种神经系统药物均对正常鼠的脾淋巴细胞无毒性，充分说明其抗肿瘤作用的安全性，且在6种药物中只有东莨菪碱、氯雷他定和硫利达嗪对胃肠肿瘤细胞在体外有抑制作用。接下来，将具有体外抗肿瘤作用的药物硫利达嗪、氯雷他定、东莨菪碱加上舒乐安定4种药物进行不同组合进一步研究联合抗肿瘤作用，结果发现硫利达嗪和氯雷他定的联合处理，在体外抑制胃肠道肿瘤细胞生长最为有效。

当评估肿瘤生长的抑制水平时，只有相对高的浓度，10 μmol/L的硫利达嗪或者50 μmol/L的氯雷他定单独使用时可以对小鼠结肠癌细胞（CT26.WT）和小鼠胃癌细胞（MFC）显示出细胞毒性。然而，10 μmol/L的硫利达嗪与25 μmol/L的氯雷他定在鼠源的结肠癌细胞（CT26.WT）的CI值为0.78，鼠源胃癌细胞（MFC）的CI值为0.55，均小于1，显示出了协同效应。基于以上结果，发现硫利达嗪与氯雷他定组合的最适浓度，为下一步研究神经系统药物联合化疗药物治疗胃肠道肿瘤进而提高抗肿瘤的疗效奠定基础。

由于单药治疗癌症的效率有限，因此越来越多的证据表明，联合疗法可以增加任何单一药物的有效性。硫利达嗪，一个被广泛用于治疗精神疾病的药物，已有报道显示可以选择性的靶向白血病肿瘤干细胞[13]，并且在卵巢癌移植瘤中，通过抑制VEGFR-2/PI3K/mTOR的信号通路，起到抑制血管生成的作用[18]。硫利达嗪联合多柔吡星可以增强抗癌药物多柔吡星在多药耐药肿瘤细胞内的浓度，而达到更好的抗癌效果[19]。氯雷他定，一种全世界广泛用于口服的抗组胺剂，也有报道显示通过G2/M期细胞周期阻滞，起到抗肿瘤的效应[20]。

此次研究首次揭示了硫利达嗪和氯雷他定联合应用在体外显示出更有效的抗胃肠癌的效应，为进一步研究神经系统药物对胃肠道肿瘤的调控机制及与化疗药物联用提高抗肿瘤疗效奠定了基础，并且为胃肠道肿瘤的治疗方法提供了一种潜在策略。

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Study of the effect of Thioridazine combined with Loratadine on the gastrointestinal tumor suppressor

ZHANG Jin-mei1KANG Wen-quan1JIN Guang-yi2CHEN Ting-ting2,3▲
1.Department of Gastroenterology,Nanshan District People′s Hospital of Shenzhen,Guangdong Province,Shenzhen 518052, China;2.Department of Pharmacy,School of Medicine,Shenzhen University,Guangdong Province,Shenzhen 518060,China;3.Department of Cardiology,Shenzhen People′s Hospital(the Second Clinical Medical College of Jinan University), Guangdong Province,Shenzhen 518020,China

[Abstract]ObjectiveTo discuss the preliminary effect of nervous system drugs on gastrointestinal tumors.MethodsThioridazine,Loratadine,Scopolamine,Dopamine,Acetylcholine and Estazolamum(0.01,0.1,1,10,100 μmol/L),six classical nervous system drugs were selected to detect the activities of gastrointestinal tumor in vitro by using CCK-8 assay.The spleen cells of mice were also used as the model to study the safety of the nervous system drugs in vitro.ResultsAmong six classical nervous system drugs,cell growth on human colon and gastric cancer clells were suppressed by 100 μmol/L scopolamine,100 μmol/L Loratadine and 10 μmol/L Thioridazine (P<0.05),especially the combination of Thioridazine and Loratadine.Six drugs only played roles in killing tumors cells,while the spleen lymphocytes of normal mice were non-toxic.The growth of mouse gastrointestinal carcinoma cells in vitro were inhibited by 10 μmol/L thioridazine and 25 μmol/L Loratadine.ConclusionThioridazine combined with Loratadine is proved to enhance anti-gastrointestinal tumor effects in vitro,and provides a new strategy for forward combination treatment.

[Key words]Thioridazine;Loratadine;Nervous system drugs;Gastrointestinal tumor;Combination therapy

[中图分类号]R979.1

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）04（c）-0004-05

（收稿日期：2017-03-13 本文编辑：任 念）

[基金项目]广东省深圳市南山区科技创新局重点资助项目（南科研卫2015003）

[作者简介]张金梅（1978-），女，湖北随州人，硕士，主治医师，研究方向：消化系统肿瘤

▲通讯作者：陈婷婷（1985-），女，山东人，博士，助理研究员，研究方向：免疫炎症