庞逸敏1甘露1王献哲1苏棋1郭哲2▲何萍3▲

1.广西医科大学药学院药理学教研室，广西南宁530021；2.广西医科大学第三附属医院急诊科，广西南宁530021；3.广西医科大学实验动物中心，广西南宁530021

[摘要]目的建立脂多糖（LPS）诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型，探讨塞来昔布对其分泌炎症因子的影响。方法培养小鼠RAW 264.7巨噬细胞，采用1 μg/ml的LPS刺激小鼠RAW 264.7巨噬细胞24 h后，收集细胞培养基，采用Griess法测定一氧化氮（NO）及ELISA法测定肿瘤坏死因子α（TNF-α）、前列腺素E2（PGE2）的含量，从而建立LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型。采用MTT法检测塞来昔布对LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞的毒性作用后，选用8.00 μmol/L塞来昔布预处理细胞1 h，再加入1 μg/ml LPS刺激细胞24 h，收集细胞培养基，测定培养基中炎症因子NO、TNF-α及PGE2的含量。结果1 μg/ml的LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞24 h后，细胞形态出现明显变形，细胞培养基中炎症因子NO及TNF-α、PGE2含量均较正常对照组明显增高（P＜0.01）。与DMSO溶剂对照组相比，8.00 μmol/L塞来昔布组能明显抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎性因子NO、TNF-α及PGE2的释放（均P＜0.01）。结论成功建立LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型，塞来昔布可明显抑制其炎症因子NO、TNF-α及PGE2的分泌。

[关键词]塞来昔布；RAW 264.7巨噬细胞；脂多糖；一氧化氮；肿瘤坏死因子α；前列腺素E2

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是严重危害人类健康的常见病与多发病，也是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。近年来，AS被普遍理解为一种发生在血管壁的慢性炎症[1]。巨噬细胞是AS炎症病理过程中的代表性细胞，巨噬细胞及巨噬细胞相关的主要生物大分子在AS的发生、发展全过程中起重要作用[2]。RAW 264.7细胞是小鼠肿瘤来源的单核/巨噬细胞系株，被细菌内毒素的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后会释放多种过量的炎症因子，是AS研究中常用的炎症细胞模型。

环氧合酶-2（COX-2）选择性抑制剂是目前广泛使用的非甾体类抗炎药（NSAIDs）。与传统的NSAIDs相比，COX-2选择性抑制剂在具有镇痛、抗炎作用的同时，也具有良好的胃肠道安全性[3]。但自21世纪初以来，默克公司宣布全球主动撤回高选择性COX-2抑制剂罗非昔布的举动，引起了全球对于COX-2选择性抑制剂心血管危险的关注。大量研究显示，对于原有心血管病疾病的患者，COX-2选择性抑制剂可能增加心肌梗死、脑卒中等严重心脑血管方面的危险[4-6]，而COX-2选择性抑制剂对AS的作用也始终存在争议[7]。

本研究以小鼠RAW 264.7巨噬细胞为研究对象，采用LPS诱导其活化建立巨噬细胞炎症模型，同时观察COX-2选择性抑制剂塞来昔布（Celecoxib）对LPS诱导的巨噬细胞炎症因子分泌的影响，以初步探讨COX-2选择性抑制剂对AS及相关心脑血管疾病的影响及其可能机制。

1.1 材料

1.1.1 细胞株与试剂塞来昔布（纯度≥98%，Sigma公司），二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）；小鼠RAW264.7巨噬细胞（中国科学院上海细胞库）；DMEM高糖培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（GemCell公司）；青链霉素混合液（100×）（北京索莱宝科技有限公司）；脂多糖（LPS L2880，Sigma公司）；MTT（Biosharp生物科技）；一氧化氮（NO）试剂盒（碧云天生物公司）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒（武汉博士德公司）；前列腺素E2（PGE2）ELISA试剂盒（美国Cayman公司）。

1.1.2 仪器酶标仪（美国Molecular Devices公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠RAW 264.7巨噬细胞的培养将RAW 264.7巨噬细胞接种在含10%胎牛血清（＜0.5 EU/ml）、1%青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱内培养。当细胞覆盖率达到约90%时，弃掉上清，直接加入37℃培养基吹打传代。取对数期细胞用于后续实验。

1.2.2 LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型的建立取对数期生长的RAW 264.7细胞以每孔20× 103个细胞接种于96孔细胞培养板中，待24 h细胞贴壁后，设置正常对照组和LPS模型组，每组6个复孔。正常对照组以无血清DMEM培养基孵育细胞，LPS模型组则以含1 μg/ml LPS的无血清DMEM培养基孵育细胞，孵育24 h后，观察细胞形态变化，并收集细胞培养基测定炎症因子NO及TNF-α、PGE2含量[8]。

1.2.3 MTT法检测塞来昔布对LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞的细胞毒性试验取对数期生长的RAW 264.7细胞以每孔3×103个细胞接种于96孔细胞培养板中，待24 h细胞贴壁后，设置正常对照组、LPS模型组、塞来昔布组（塞来昔布＋LPS）及DMSO溶剂对照组（DMSO＋LPS），每组6个复孔。正常对照组和LPS模型组先以无血清DMEM培养基孵育细胞，塞来昔布组分别以含终浓度为40.00、30.00、10.00、8.00、3.00、1.00、0.30、0.10、0.03 μmol/L塞来昔布的无血清DMEM孵育细胞，DMSO溶剂对照组则在无血清DMEM中加入等体积DMSO孵育细胞。按上述处理方式孵育细胞1 h后，除正常对照组采用无血清DMEM继续孵育外，其余各组再加入终浓度为1 μg/ml LPS刺激细胞，24 h后收集各孔培养基，在每孔中加入5 g/L MTT 10 μl，补足DMEM至100 μl（MTT终浓度为0.5 g/L），继续培养4 h后弃上清，每孔加入150 μl DMSO，震荡10 min，在570 nm处测量各孔的吸光度。

1.2.4 塞来昔布对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症因子分泌的影响取对数期生长的细胞以每孔20×103个细胞接种于96孔的细胞培养板中，待24 h细胞贴壁后，设置正常对照组、塞来昔布组（塞来昔布+LPS）及DMSO溶剂对照组（DMSO＋LPS），每组6个复孔。各组处理方式同“1.2.3”，塞来昔布组仅采用8 μmol/L塞来昔布孵育细胞。以上三组分别处理完毕后，收集细胞培养基测定炎症因子NO及TNF-α、PGE2的含量。

1.2.5 NO、TNF-α和PGE2的含量测定按上述处理方式收集各孔细胞培养基后，分别采用Griess法测定NO及ELISA法测定TNF-α、PGE2含量，操作参照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行处理，计量资料以±s表示，两样本均数的比较采用Student TTest检验，多样本组间均数的比较采用One-way ANOVA检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症细胞模型的建立

作用24 h后在显微镜下进行形态学观察，正常对照组RAW 264.7巨噬细胞体积较小，呈边缘明亮的类圆形，偶有细长触角，符合巨噬细胞形态；经1 μg/ml LPS刺激24 h后，细胞体积明显增大并伸出大量伪足，呈菱形、梭形、长条形等不规则形状，且细胞内有大量空泡。与正常对照组相比，LPS模型组NO及TNF-α、PGE2含量均明显增高（P＜0.01）（图1、图2）。

2.2 MTT法测定塞来昔布对LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞的细胞毒性试验

经MTT法检测，LPS模型组及DMSO溶剂对照组的细胞存活率与正常对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。40、30 μmol/L塞来昔布组的细胞存活率较正常对照组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；10.00、8.00、3.00、1.00、0.30、0.10、0.03 μmol/L塞来昔布组的细胞存活率则与正常对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），且8.00 μmol/L塞来昔布组的细胞存活率接近100%，故选用8 μmol/L塞来昔布进行后续实验（图3）。

2.3 塞来昔布对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症因子分泌的影响

与正常对照组相比，DMSO溶剂对照组炎症因子NO、TNF-α及PGE2的含量均明显增高（P＜0.01）；与DMSO溶剂对照组相比，8 μmol/L塞来昔布组能明显抑制LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎性因子NO、TNF-α及PGE2的分泌（均P＜0.01）（表1）。

炎症反应是多细胞因子通过调节促炎和抗炎系统之间的平衡而参与炎症发生、发展的过程。目前，在体外细胞炎症模型制作中，LPS是最主要、作用最强的促炎手段。LPS是革兰阴性杆菌细胞壁外膜的主要组分，能诱导活化炎症细胞引起炎症反应，从而导致多种促炎性细胞因子的产生，促炎性细胞因子的分泌可诱导炎性细胞的进一步激活，从而导致过度或失控的炎症反应，最终引起组织器官的炎性病理损伤。

AS具有慢性炎症反应特征的病理过程，其发展始终伴随炎症反应。单核/巨噬细胞是AS炎症反应的重要效应细胞，一方面，巨噬细胞产生多种炎性细胞因子，促进血栓形成，扩大斑块面积，增加斑块的不稳定性，在AS病理过程中发挥关键作用；另一方面，巨噬细胞也可产生如白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等抗炎因子，增加AS斑块的稳定性，进而起保护作用[9]。

炎症因子TNF-α、NO及PGE2作为经典的急性炎症早期细胞因子，常用于衡量炎症模型成功与否的标准[10-11]。其中，TNF-α是巨噬细胞在炎症反应中产生的主要促炎细胞因子，在机体中可影响包括细胞增殖、分化及凋亡等一系列细胞功能的调节，其表达增加还可促进氧自由基的产生导致内皮功能紊乱，是AS进程中非常重要炎性因子[12]。NO是一种有重要生物学意义的无机小分子，具有杀灭细菌等病原体微生物活化巨噬细胞的作用[13]，能够介导炎症反应。NO由一氧化氮合酶（NOS）经一系列氧化还原反应生成，在动脉粥样硬化浸润的巨噬细胞中，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达增高，由iNOS衍生的过量NO诱导的硝化应激会引起过度炎症反应，加重动脉粥样硬化[14]。PGE2是COX-2的主要代谢产物，COX是催化花生四烯酸（AA）合成各种内源性前列腺素（PGs）和血栓素（TXs）的限速酶。COX主要分为COX-1和COX-2，其中COX-2酶为诱导型酶。COX-2通常被认为主要与炎症等过程中PGs的生成相关，与AS的发生发展成正相关。COX-2表达局限在粥样斑块的巨噬细胞/泡沫细胞、平滑肌细胞和内皮细胞中，在炎性因素影响下COX-2及其产物PGE2可被迅速诱导表达，促进AS炎症反应的发生和发展[15]。本实验结果显示，1 μg/ml LPS诱导24 h后，RAW 264.7巨噬细胞发生了明显的活化的形态学改变，炎症因子NO、TNF-α及PGE2分泌水平亦较正常对照组显著上升，差异有统计学意义（P＜0.01），提示已成功建立LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型。

虽然较多实验发现COX-2抑制剂能减轻血管炎症、减少单核细胞浸润、改善血管壁细胞功能而延缓AS进程、增加斑块稳定性，从而减少AS血栓事件[16]，但也有COX-2抑制剂加重AS[17]或对AS无影响[18]的报道。为探讨COX-2选择性抑制剂对AS及相关心脑血管疾病的影响及可能机制，在成功建立LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型基础上，本实验初步观察了COX-2选择性抑制剂塞来昔布对LPS诱导的巨噬细胞部分炎症因子分泌的影响。MTT结果显示，0.03～10.00 μmol/L的塞来昔布对LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞无明显细胞毒性（与正常对照组比较，P＜0.05）。以细胞存活率接近100%的8.00 μmol/L塞来昔布作用于LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞后，可明显抑制LPS诱导的RAW 246.7巨噬细胞炎症因子NO、TNF-α及PGE2的分泌。塞来昔布通过选择性抑制COX-2酶可抑制炎症因子PGE2的生成，但塞来昔布通过何种机制抑制炎症因子NO及TNF-α的生成？此外，塞来昔布在抑制NO、TNF-α及PGE2等炎症因子分泌的同时，为何却可增加AS及相关心血管事件的发生？因此，有必要在此炎症细胞模型基础上展开进一步研究。

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Influence of Celecoxib on inflammatory cytokines of inflammation model in RAW 264.7 macrophages induced by lipopolysaccharide

PANG Yi-min1GAN Lu1WANG Xian-zhe1SU Qi1GUO Zhe2▲HE Ping3▲
1.Department of Pharmacology,School of Pharmacy,Guangxi Medical University,Nanning530021,China;2.Department of Emergency,the Third Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning530021,China;3.Laboratory Animal Center,Guangxi Medical University,Nanning530021,China

[Abstract]Objective To investigate the influence of Celecoxib on the secretion of inflammatory cytokines in RAW 264.7 macrophages model induced by lipopolysaccharide(LPS).Methods Mouse RAW 264.7 macrophage was cultured. 24 h after mouse RAW 264.7 macrophage was stimulated by LPS 1 μg/ml,then cell culture medium was collected.NO was tested by using Griess and the content of TNF-α and PGE2was tested by ELISA.Then the RAW 264.7 macrophage inflammation model was established.The toxic effect of celecoxib on LPS stimulated RAW 264.7 macrophages assayed by MTT.8.00 μmol/L Celecoxib was used to pretreat cell for 1 h,following of 1 μg/ml LPS added to stimulate cell for 24 h. Cell culture medium was collected to test the content of inflammatory factors NO,TNF-α and PGE2in culture medium. Results After 1 μg/ml of LPS stimulated RAW macrophages for 24 h,cell morphology changed obviously,the content of inflammatory factors NO,TNF-α and PGE2in culture medium were obvious higher than those of the control group(P＜0.01).Compared with DMSO control group,8.00 μmol/L Celecoxib group could significantly inhibit the release of inflammatory cytokines NO,TNF-α and PGE2induced by LPS in RAW 264.7 cells(P＜0.01).Conclusion Establishment of LPS induced macrophage model of RAW 264.7 and celecoxib can obvious inhibit the release of inflammatory cytokines NO,TNF-α and PGE2.

[Key words]Celecoxib;RAW 264.7 macrophage;Lipopolysaccharide;NO;TNF-α;PGE2

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）04（a）-0004-04

（收稿日期：2017-02-24本文编辑：祁海文）

[基金项目]国家自然科学基金项目（81360056）；广西壮族自治区南宁市科学研究与技术开发计划项目（20153105）

[作者简介]庞逸敏（1991-），女，硕士，研究方向：心脑血管药理学

▲通讯作者：郭哲（1975-），男，本科，主治医师，研究方向：心脑血管急诊；何萍（1975-），女，博士，教授，研究方向：心脑血管药理学