范 隽1，2赵昌敏3刘兆芳4胡文婷2逄明杰2▲
1.潍坊医学院临床学院，山东潍坊 261000；2.青岛市市立医院耳鼻喉科，山东青岛 266000；3.广东省惠州市中信惠州医院麻醉科，广东惠州 516006；4.山东省菏泽市市立医院耳鼻喉科，山东菏泽 274000；

[摘要]目的 观察p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）在慢性鼻-鼻窦炎（CRS）不伴鼻息肉（CRSsNP）、CRS伴鼻息肉（CRSwNP）以及正常钩突黏膜组织中表达程度的差异以及不同类型的CRS中细胞因子白介素6（IL-6）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，探讨并分析p38MAPK信号通路在CRS中可能的作用机制。方法 选取2015年7月~2016年7月青岛市市立医院耳鼻喉科行鼻内镜手术患者，32例CRSsNP患者窦口组织、30例CRSwNP患者鼻息肉组织和24例正常钩突黏膜组织，分别采用蛋白质印迹法（Western Blot）检测p38MAPK在三组中的蛋白表达量、用逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测IL-6、HIF-1α和VEGF在三组中的信使核糖核酸（mRNA）的表达水平。结果p38MAPK在CRSsNP、CRSwNP中的表达均高于正常黏膜组织，而两组实验组间的表达差异无统计学意义（P=0.143）；IL-6在CRSsNP、CRSwNP中的表达均高于正常黏膜组织，而两组实验组间的表达差异无统计学意义（P=0.082）；HIF-1α和VEGF在CRSwNP中表达均明显高于正常组织（P<0.05），而VEGF在CRSsNP组织和正常组织中的表达差异无统计学意义（P=0.075）。结论p38MAPK在CRSsNP和CRSwNP中呈现出与炎性因子IL-6不同的相关性；IL-6在CRSsNP和CRSwNP中表达优势不同，在CRSsNP组织中表达量更显著，与其关系更密切；HIF-1a及VEGF在CRSwNP组织中同时呈高表达，可能与息肉的产生相关。

[关键词]p38丝裂原激活的蛋白激酶；白细胞介素-6；缺氧诱导因子1α；血管内皮生长因子；慢性鼻-鼻窦炎

慢性鼻-鼻窦炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是鼻窦及鼻腔的慢性炎性疾病。其特点是病程较长，反复发作，经久难愈。常见临床症状有流脓涕、鼻塞、嗅觉障碍，甚至头痛等[1-2]。据2012年昆明标准[3]，CRS分为两种类型：①CRS不伴鼻息肉 （chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP）；②CRS伴有鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）。炎症产生离不开炎性因子的激活、诱导。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通过三级激酶模式依次激活后，共同调节细胞的生长、分化、炎症反应等，在信号转导过程中发挥重要作用。p38MAPK是第1个被证实的作为抗炎药物的靶向目标，对前炎症细胞因子，如白介素6（interleukin-6，IL-6）起重要调节作用。而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是由于缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1-alpha，HIF-1α）的高表达诱导产生的[4]，同时又加重炎症及息肉的形成[5-6]。本课题组前期研究表明[7]，p38MAPK信号通路能够对变应性超敏反应及炎性反应进行调节，但在CRSsNP及CRSwNP的不同炎性反应中，p38MAPK是否对IL-6、HIF-1α和VEGF具有调节作用以及调节表达的差异性尚不清楚。本研究拟探讨在不同类型CRS患者炎性组织中，P38MAPK是否对上述细胞因子起调控作用，通过各自表达的差异性，进一步阐明CRS的发病机制。

1.1 一般资料

本研究通过我院医学伦理委员会批准，受试者在术前同意参与本次研究并签署知情同意书，所有受试对象均来源于2015年7月~2016年7月青岛市市立医院耳鼻喉科行鼻内镜手术患者，按照慢性鼻窦炎诊疗评定标准（昆明标准）[2]，受试者均无变应性鼻炎、支气管哮喘、阿司匹林耐受不良和其他系统严重疾患。典型鼻窦炎症状持续≥12周，术前1个月内未行激素和抗组胺药物治疗。实验共分为3组，CRSsNP组32例，其中男 15例，女 17例；平均年龄（41.00± 17.39）岁；鼻内镜检查无息肉形成，副鼻窦CT示窦腔有软组织密度影，取窦口黏膜组织。CRSwNP组30例，男17例，女13例；平均年龄（39.00±19.45）岁；鼻内镜检查有息肉形成，术后经病理证实为黏膜息肉，取息肉组织；对照组24例，男14例，女10例；平均年龄（33.00±13.09）岁；鼻窦CT示窦腔无软组织影，中鼻道无赘生物，取单纯鼻中隔偏曲矫正术中的正常钩突黏膜组织。所有组织标本取出后经PBS液（上海碧云天生物技术公司）清洗后一部分置于RNA保存液（北京天根生化科技有限公司）用于mRNA的提取及RT-PCR的分析，一部分置于-80℃超低温冰箱（青岛海尔集团）中保存用于Western blot检测蛋白含量。

1.2 研究方法

1.2.1 RT-PCR检测细胞内IL-6、HIF-1α和VEGF mRNA表达量 根据动物组织总RNA提取试剂盒说明书（北京天根生化科技公司）提取细胞总RNA，从总RNA提取出2 μg，按照cDNA第一链合成试剂盒说明书（北京天根生化科技有限公司）合成cDNA第一链，进行gDNA去除反应，逆反应体系1为：5×g DNA Buffer 2 μl，Total RNA 500 ng，RNase-Free ddH2O补足至10 μl；反应结束后于42℃水浴孵育3 min。在冰上进行逆转录反应2，反应体系为：10× Fast RT Buffer 2 μl，RT Enzyme Mix 1 μl，FQ-RT Primer Mix 2 μl，RNase-Free ddH2O补足至10 μl，将体系2转移至已孵育完成的体系 1中，42℃孵育15 min，95℃孵育3 min，冰浴5 min，得到cDNA。经PCR仪 （赛默飞世尔科技）进行PCR扩增，引物及GAPDH（北京天根生化科技公司）序列如表1。配制1.5%琼脂糖（西班牙进口）凝胶电泳，凝胶成像仪（美国BIO-RAD公司）下观察条带照相，Image J图像分析软件分析电泳条带灰度值，各组与GAPDH灰度值比表示该组mRNA相对表达量。

表1 PCR引物序列

1.2.2 Western blot检测细胞核内p-p38蛋白表达量 根据细胞核蛋白质提取试剂盒说明书（上海生工生物工程公司）提取细胞核蛋白，BCA蛋白定量方法测定细胞核浓度，配制SDS-PAGE凝胶（上海碧云天生物公司），上电泳仪（美国BIO-RAD公司）行凝胶电泳分离蛋白质，转膜，封闭1 h，加入稀释度为1∶500 的p-p38兔抗人单克隆抗体及稀释度为1∶500的p38兔抗人单克隆抗体（美国Millipore公司）孵育。回收一抗后，加入HRP（美国Millipore公司）标记稀释浓度为1∶1000的二抗鼠抗兔IgG多克隆抗体（美国Millipore公司）孵育，TBST液洗涤，ELC显色。扫描仪（赛默飞世尔科技）扫描，用Image J分析软件分析蛋白条带灰度值，以各组与总p38的蛋白条带灰度值比值表示p-p38蛋白相对活化水平。

1.3 统计学方法

所得数据输入SPSS 19.0软件进行统计学处理，计量资料用单因素方差（one-way ANOVA）分析，差异有统计学意义，满足方差齐性，采用Tukey检验进行比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 IL-6、HIF-1α和VEGF mRNA的表达

CRSsNP组、CRSwNP组和对照组中的 IL-6、HIF-1α和VEGF mRNA表达量见表2。IL-6 mRNA 在CRSsNP组、CRSwNP组中的表达量高于对照组，而两组实验组中的表达差异无统计学意义（F=64.73，P=0.082）（图1-a）；HIF-1α mRNA的表达量在CRSs-NP组、CRSwNP组明显高于对照组，三组之间比较，差异均有统计学意义（F=256.39，P<0.05）（图1-b）；VEGF mRNA的表达量在 CRSwNP组明显高于CRSsNP组和对照组，但CRSsNP组中的表达与对照组差异无统计学意义（F=58.95，P=0.075）（图1-c）。

表2 三组IL-6、HIF-1α和VEGF mRNA表达水平的比较（±s）

 

A：CRSsNP组；B：CRSwNP组；C：对照组；PAB：A、B组比较，余同上

 

图1 RT-PCR分析IL-6、VEGF、HIF-1α 及GAPDH的基因表达

a：IL-6；b：HIF-1α；c：VEGF；A：CRSsNP组；B：CRSwNP组；C：对照组；M：D2000MAKER；G：GAPDH

2.2 p38MAPK蛋白表达水平

总p38及磷酸化p38凝胶电泳结果如图2。磷酸化p38在CRSsNP组、CRSwNP组以及对照组灰度的相对值分别为：0.6641±0.0461，0.7464±0.0914，0.2816± 0.04002。三组比较，差异有统计学意义（F=76.32，P< 0.05）。CRSsNP组与CRSwNP组比较，差异无统计学意义（P=0.143）；两组实验组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（图2）。

 

图2 Western blot测定各组细胞内p38及细胞核内p-p38的蛋白表达

炎性细胞的刺激分泌是CRS的反复发作的主要原因之一，而刺激炎症细胞分泌是多种因素共同作用的结果，其中一种就是p38MAPK信号通路的激活。p38MAPK信号通路在未受刺激时主要分布于胞浆中，胞核区很少分布，经三级酶促级联反应后形成磷酸化p38，可进入细胞核中传递信息，进而作用于多种其他转录因子[8]，促进促炎因子的产生[9]。曾有研究表明：p38MAPK信号通路对鼻息肉的发生发展可能有一定的耦联作用[10]，本次研究中，p-p38MAPK在CRSwNP中的高表达也证实了此说法。但同时在本研究中，CRSsNP与CRSwNP中p-p38MAPK的蛋白含量无明显差异，IL-6在两者中的表达也无明显差异，可推断，炎症的发生与p38MAPK及IL-6均有关。IL-6通过局部炎症微环境调控，在鼻黏膜炎性反应过程中起重要作用[11]，当鼻腔的炎症细胞受某种因素刺激后，以自分泌或旁分泌形成产生，并作用于产生细胞自身，加重机体炎性反应[12-13]。

在临床上，CRSsNP患者黏膜组织充血水肿，淋巴细胞和浆细胞弥漫浸润，炎性因子分泌，纤维组织增生致使血管堵塞，从而腺体萎缩，故表现为下鼻甲萎缩而中鼻甲反而明显水肿，中鼻道变狭窄，鼻腔通气较差。而鼻通气障碍使鼻腔局部氧含量的降低，形成缺氧状态，诱导缺氧因子的分泌，尤其是转录因子HIF-1α的分泌，又促进了VEGF生成血管，为缺氧组织提供血供，水肿的黏膜组织呈息肉样变。VEGF作为最强有力的血管通透因子，具有增加微血管通透性的功能，在体内可诱导血管的发生[14]。本研究中，CRSwNP患者息肉组织中的HIF-1α和VEGF mRNA均呈高表达，这是因为当鼻腔狭窄，局部氧浓度降低，鼻黏膜细胞相互连接为“拟态血管”[15]，能为息肉早期供氧及促进生长速度。国内外研究证实，在低氧或缺血条件下，HIF-1α能增加VEGF mRNA的转录，缺血或缺氧组织可以通过释放旁分泌因子或调节转录后机制上调VEGF受体的表达，从而启动血管新生[16]。低氧可以诱导mRNA编码VEGF稳定性增加[17]。缺乏HIF-1α的表达，VEGF mRNA水平显著降低，即使在低氧条件下，VEGF mRNA也未被诱导表达[18]。

综上所述，当鼻腔受到外界炎性反应刺激时，p38MAPK活化形成p-p38MAPK，诱导炎性因子IL-6的高表达。鼻黏膜炎症持续发展，没有得到有效控制时，促炎症细胞因子如IL-1、IL-6和TNF等在维持炎症过程中起了重要作用，又由于解剖结构的差异性以及鼻黏膜水肿持续存在，鼻腔通气引流较差，又诱导了缺氧因子HIF-1α在巨噬细胞的高表达，而VEGF对毛细血管和小静脉的特异性通透性，使血管通透性增加，使大分子物质易于穿透血管壁，导致血浆外渗，细胞外液增多，使组织发生水肿。水肿鼻黏膜组织的上皮层不断增殖增厚，逐渐形成生长性组织即鼻息肉，又反过来刺激VEGF的分泌来提供血管[19]。

但是，有关CRS不同类型患者组织中IL-6表达的结果并不一致，如肖志超[20]的研究显示，IL-6在单纯CRS患者及CRSwNP患者黏膜中的表达量无明显差异性。在黄正华等[21]的研究中HIF-1α mRNA与VEGF mRNA的表达水平在鼻息肉组与对照组中无明显差异性。不同结果的产生可能是由于实验方法不同，也可能由于病情差异而表现不同，因此还有待进一步研究和证实。同时，研究p38MAPK信号通路对IL-6、HIF-1α与VEGF的影响及其相互关系，也在难治性CRS复发的控制与治疗中有一定的临床意义。

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The influence of p38MAPK signal pathway regulateing expression of IL-6,HIF-1α and VEGF on the chronic rhinosinusitis

FAN Jun1,2ZHAO Chang-min3LIU Zhao-fang4HU Wen-ting2PANG Ming-jie2▲
1.Clinical Medical School,Weifang Medical University in Shandong Province,Weifang 261000,China;2.Department of Otolaryngology,Qingdao Municipal Hospital in Shandong Province,Qingdao 266000,China;3.Department of Anesthesia,Citic Huizhou Hospital of Huizhou City in Guangdong Province,Huizhou 516006,China;4.Department of Otolaryngology,Heze Municipal Hospital in Shandong Province,Heze 274000,China

[Abstract]Objective To observe the difference of the degree of expression of p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK)in chronic rhinosinusitis(CRS)without nasal polyps(CRSsNP),CRS with nasal polyps (CRSwNP)and normal uncinate process,and the expression of interleukin-6 (IL-6),hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α)and vascular endothelial growth factors(VEGF)in different types of CRS.And explore the possible mechanism of p38MAPK signaling pathway in CRS.Methods Patients with nasal endoscopic surgery in department of otolaryngology of Qingdao Municipal Hospital were selected from July 2015 to July 2016 in Qingdao municipal hospital otolaryngology.32 cases of patients with CRSsNP sinus tissue,30 cases of CRSwNP patients with nasal polyps and 24 cases of with normal uncinate mucosa were selected for the study.The protein expression of p38 MAPK in three groups was detected by Western blotting.And the mRNA expression levels of IL-6,HIF-1α and VEGF in three groups were detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results The expression of p38MAPK in CRSsNP and CRSwNP was higher than that in normal mucosa,but there was no sig nificant difference between the twogroups(P=0.143).The expression of IL-6 in CRSsNP and CRSwNP was higher than that in normal mucosa,but there was no significant difference between two groups (P=0.082).The expression of HIF-1α and VEGF in CRSwNP was significantly higher than that in normal tissues (P<0.05).While there was no significant difference in the expression of VEGF in CRSsNP and normal tissues(P=0.075).Conclusion p38 MAPK in CRSsNP and CRSwNP shows a different correlation with inflammatory factor IL-6,and the advantage of the expression of IL-6 in CRSsNP and CRSwNP is different,and the expression of IL-6 in CRSsNP is more significant and more closely related.HIF-1a and VEGF are also highly expressed in CRSwNP tissues,which may be related to the production of polyps.

[Key words]p38 mitogen-activated protein kinase;Interleukin-6;Hypoxia-inducible factor 1 alpha;Vascular endothelial growth factor;Chronic rhinosinusitis

[中图分类号]R765.21

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）03（c）-0008-05

（收稿日期：2017-01-25本文编辑：许俊琴）

[基金项目]山东省青岛市科技局项目[2012-1-3-1-（11）-nsh]

[作者简介]范隽（1989-），女，硕士，主要从事鼻科疾病研究

▲通讯作者：逄明杰（1970-），男，硕士，硕士研究生导师，副主任医师，主要从事鼻科疾病及鼻眼相关疾病研究