闫海霞 谭 成 杜小伟 陈有根 傅欣彤▲

北京市药品检验所 北京市保健食品化妆品检验中心中药室，北京 102206

[摘要]中药是我国的传统药物，在临床和日常保健中有着越来越广泛的应用。中药材和中药饮片的质量关系到临床治疗的安全有效，对我国中医药产业的快速健康发展也至关重要。中药材和饮片的真伪鉴别一直是行业关注的焦点之一，随着生命科学技术飞跃发展，多种分子生物学技术被逐步运用于药用动植物及中药材的基源鉴定，取得较好的效果。《中国药典》自2010年版起，均收载了中药材和饮片（如蕲蛇、乌梢蛇和川贝母）的分子生物学方法，是采用新技术、新方法控制中药质量的有益尝试。标准已执行4年，但兄弟单位普遍反映在检验过程中常遇到各种技术问题，无法解决。本文以川贝母的分子生物学鉴别为例，通过总结实验过程中需要注意的技术要点以及常见问题，旨在为即将或正在从事这项检验工作的同仁们提供经验以供参考，以便更高效顺利地完成实验。

[关键词]分子生物学；川贝母；聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性

中药作为中华民族的传统用药，在临床和日常保健中有着越来越广泛的应用。中药材和中药饮片的质量关系到临床疗效及用药安全，对我国中医药产业的快速健康发展至关重要[1]。中药材和中药饮片的真伪鉴别一直是行业关注的重点，随着科学技术的进步，分子生物学方法逐步被应用于中药材的鉴别[2-6]，2010年版《中国药典》及其第一增补本收载了蕲蛇、乌梢蛇和川贝母的分子生物学鉴别方法[7-8]，并在2015年版《中国药典》中得到修订和保留[9]。这是采用新技术新方法控制中药质量的有益尝试，但兄弟单位普遍反映在检验过程中常遇到各种技术问题，无法解决。北京市药品检验所2012年即开展蕲蛇和乌梢蛇的聚合酶链式反应（PCR）鉴别，以及川贝母的聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）检验工作，至今已完成检品近200件，过程中积累一些经验和教训。笔者以川贝母为例，将检验过程中遇到的问题作一总结归纳。

川贝母始载于《诗经》中，称之为“虻”，《神农本草经》中将其列为中品，之后的历代本草均有记载[10]。川贝母作为清热润肺、化痰止咳的良药，数千年来一直多有应用，并被学者认为以“川产者为妙”[11]。2005年版《中国药典》收载的川贝母有4个基源，分别为川贝母、暗紫贝母、甘肃贝母和梭砂贝母[12]，2010年版和2015年版《中国药典》中川贝母的基源增加2个栽培品，即太白贝母和瓦布贝母，至此，川贝母的基源为6个[7-9]。川贝母价格较贵，且资源有限，市场上常见以平贝母、小伊贝母、小东贝母冒充川贝母的情况，混伪品与正品川贝母药效不同，如混用会影响用药安全[13-14]。为此，2010年版《中国药典》第一增补本收录了基于ITS序列的川贝母PCR-RFLP鉴别方法[8]，该方法利用川贝母在ITS1序列上有且只有一个SmaⅠ酶切位点，而其它川贝母在这一位置上存在碱基变异，不能被SmaⅠ识别并切割的原理，从而实现川贝母的真伪鉴别[15]。

2015 年版中国《中国药典》中川贝母的PCR-RFLP鉴别包括3个步骤：①样品的前处理、粉碎和DNA的提取；②川贝母PCR-RFLP鉴别反应；③电泳检测。在实际检验操作过程中，还应该包括正式实验之前准备试剂耗材和实验完毕之后生物废弃物的处理部分。

2.1 实验前试剂和耗材的准备及前处理

分子生物学鉴别与理化鉴别不同，前者对试剂和耗材的无菌程度要求较高，如果不注意实验前的灭菌过程，往往会导致实验失败。

在DNA提取、纯化、扩增、酶切和电泳过程中均会使用试剂，目前常用商品试剂盒，按照试剂盒使用说明操作即可；试剂盒配备的无菌超纯水，可用实验用无菌超纯水代替，为过滤超纯水经高压蒸汽灭菌30 min所得。实验中常用到的耗材，包括钢珠、镊子、刀片、滤纸、玻璃平皿、不同规格的枪头、不同规格的离心管等，都应进行高压蒸汽灭菌并烘干后使用，以免污染样品，影响实验结果。

在正式实验之前，除上述灭菌步骤外，建议用医用酒精喷洒实验台面，擦拭移液枪和一次性手套外壁，待酒精挥干之后，再开始实验。

2.2 样品的前处理、粉碎和DNA的提取

关于样品的前处理和粉碎，《中国药典》中规定“取本品0.1 g，依次用75%乙醇1 ml、灭菌超纯水1 ml清洗，吸干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉”，即为对样品进行表面灭菌后，进行研磨粉碎。手工粉碎的方法在样品批次较多时，效率较低，建议使用球磨仪进行粉碎，可更高效快速地得到样品极细粉。使用球磨仪时，将样品连同灭菌后的钢珠适量置于离心管中，利用样品、钢珠、离心管之间的高速碰撞，使样品得以粉碎，注意勿使样品长时间处于高速震荡中，以免长时间的高速震荡产生大量的热，导致样品降解，适当频率、短时间、多次研磨即可。

《中国药典》规定使用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，提取过程中需要注意的是，为将吸附柱上的DNA完全洗脱下来，建议尽量将洗脱液加在吸附柱中心的滤膜上。

PCR-RFLP实验需要随行空白和对照，分别用与样品等量的无菌超纯水和对照药材来进行实验，切勿忘记。

2.3 PCR-RFLP反应

这部分可以分为两个步骤，首先是聚合酶链式反应，即PCR扩增反应；第二步是酶切反应。

在PCR扩增反应部分，《中国药典》明确规定各种试剂和样品的加入量以及扩增条件，按照《中国药典》要求操作即可。需要注意的是，吸取试剂时，一定要排尽气泡，由于试剂的加入量都非常小，滴加试剂时，常常出现试剂聚集在枪头尖端，形成一个小液滴，难以滴下，可以将液滴打到离心管内壁上，利用其与离心管内壁的吸附作用力，将液滴留在离心管内；最后用无菌超纯水补足30 μl反应体系后，将离心管盖盖好，至于离心机中，离心30 s，以使试剂、样品和水在离心管底部充分混匀，更有利于PCR反应的顺利进行，可以大大增加扩增反应的成功率。

酶切反应，可以在滴加SmaⅠ后，再滴加适量BSA，它是一种酶切反应催化剂，能够使酶切反应进行更彻底，酶切效果更好；通常SmaⅠ与BSA的体积比约为1∶2，例如，在川贝母的PCR鉴别试验中，SmaⅠ加入量为0.5 μl，BSA的加入量为1 μl。滴加BSA后，酶切反应的体系仍为20 μl，所以无菌超纯水的加入量要相应减少。酶切反应的条件应设置为30℃，反应2 h。

2.4 电泳检测

酶切反应完成后所得到的溶液，含有标准规定的长度在100～250 bp的两条DNA条带，需要用琼脂糖凝胶电泳法进行检视。

首先，需要制胶和配制电泳缓冲液，制胶用缓冲液和电泳缓冲液应保持一致，用1%的TAE或TBE即可。制胶过程中注意做好防护，切勿烫伤，待胶溶液温度下降至60℃左右时，滴加少量GelRed，振摇混匀后缓慢倾倒入插好梳子的胶槽中，注意不要产生气泡，以免影响电泳效果。待胶凝固并冷却至室温后，即可将其转移至电泳槽中，准备电泳。

其次，依次将样品、对照药材、空白对照加入胶孔中，注意不要戳破胶孔边缘或戳穿胶孔底部，以免影响电泳效果。如果购买的商品试剂中已加入加样缓冲液，样品中无需再加入；如果没有，则需要提前将加样缓冲液分别与样品、对照药材、空白对照混匀，再依次上样。加样缓冲液有两个作用：一方面其密度较大，可使样品沉积在胶孔底部，避免样品上浮外溢，保障电泳条带密集紧凑，防止扩散；另一方面，其中添加染色剂，可以在电泳过程中指示前沿。

电泳结束后，可将凝胶置于凝胶成像仪上进行检视。正如标准中所规定，在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100～250 bp应有两条DNA条带，空白对照无条带。

2.5 废弃物的处理

实验完成后应妥善处理所产生的废弃物，该实验所使用的试剂有少量生物毒性，建议用过的枪头、试剂瓶、离心管、凝胶等废弃物，均应按照生物废弃物或医疗废弃物妥善处理，以免污染环境或对他人造成伤害。

3.1 引物聚合物问题

在电泳之后所得到的胶图上，常会在＜100 bp的位置出现一条带（图1），为引物聚合物的条带，是在PCR反应期间，一部分引物之间相互聚合所产生的。

3.2 胶图中除目标条带外，出现多条条带

如图2所示，除100～250 bp的两条目标DNA条带外，还有些杂乱不明显的条带，通常是由于实验过程中的操作不规范，样品被污染，出现其它物种的DNA条带。实验前的灭菌过程和实验过程中的规范操作是保证样品不被污染的重要条件。

3.3 胶图中的条带出现弥散的情况

可能原因有两点：一方面可能是制胶所用缓冲液与电泳缓冲液不一致，应保持一致；另一方面，可能是电泳缓冲液长期未更换，缓冲盐浓度变化，或缓冲液被污染，应及时更换缓冲液。

3.4 设置污染区的问题

虽然显色剂GelRed毒性较小，仍建议设立污染区和非污染区，安排专用容器盛放加有GelRed的琼脂糖凝胶，佩戴专用手套拿取被污染容器，不要用可能被污染的手套接触冰箱把手、移液枪、电脑键盘和鼠标等公用器材，共同维护实验室生物安全。

3.5 酶切实验的问题

川贝母分子生物学鉴别实验的难点在于酶切反应，检验人员普遍反映酶切反应成功率低。经考察，实验成败的关键点在于酶切试剂的加入，前文已详细介绍酶切试剂的加入量及加入种类，此处不再赘述。

以上技术要点和常见问题是在检验和研究工作中积累和总结的经验教训，将其整理成文，以帮助从事相关工作的同仁们更为顺利地完成实验。

分子生物学技术在中药鉴定方面的应用方兴未艾，目前仅有蕲蛇、乌梢蛇和川贝母的分子生物学鉴别收入 《中国药典》标准，分别采用了PCR和PCRRFLP鉴别方法；DNA条形码方法在中药材鉴定方面取得较好的效果[16-17]，《中国药典》2015年版四部收载了“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”，但《中国药典》一部正文中尚无品种采用该方法鉴别[18]。分子生物学为解决中药材的多基源问题打开了一扇门，但在面对药材和饮片掺伪问题及同一药材种下等级鉴别时，仍时有困难。中药鉴定道阻且长，需要经验鉴别、分子生物学技术、理化鉴别和显微技术的共同合作，才能真正实现中药材和饮片的明确鉴定，才能保障中药产业的长足发展。

[1]齐耀东，高石曼，刘海涛，等.中药材质量可追溯体系的建立[J].中国中药杂志，2015，40（23）：4711-4714．

[2]Pathak H，Jaroli DP.DNA finger printing analysis of enght species of Dendrobium found in western ghats using RAPD and ISSR[J].Indian J Funda App Life Sci，2012，1（2）：306-309.

[3]周亭亭，于文静，李明成，等.川贝母DNA检测试剂盒的研制与评价[J].中国药学杂志，2014，49（6）：501-504.

[4]谭莹，张丽华，李明成，等.中药材川贝母DNA指纹鉴定研究[J].中国药学杂志，2011，46（1）：14-16.

[5]唐晓晶，冯成强，黄璐琦，等.高特异性PCR方法鉴别乌梢蛇及其混淆品[J].中国药学杂志，2007，42（5）：333-336.

[6]Kang JY，Lu JJ，Qiu S，et al.Dendrobium SSR markers play a good role in genetic diversity and phylogenetic analysis of Orchidaceae species[J].Sci Hortic，2015，183（183）：160-166.

[7]国家《中国药典》委员会.中国药典[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：34-35.

[8]国家《中国药典》委员会.中国药典[M].第一增补本.北京：中国医药科技出版社，2010：83-84.

[9]国家《中国药典》委员会.中国药典[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2015：36-37.

[10]肖培根.新编中药志[M].1卷.北京：化学工业出版社，2002：111-114.

[11]金世元.中药材传统鉴别经验[M].北京：中国中医药出版社，2012：27-30.

[12]国家《中国药典》委员会.中国药典[M].一部.北京：化学工业出版社，2005：25-26.

[13]颜晓燕，童志远，晏子俊，等.暗紫贝母、栽培瓦布贝母及浙贝母药效学比较[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（10）：244-248.

[14]曹新伟.川贝母的化学成分研究与贝母属药用植物质量评价[D].北京：中国协和医科大学，2008.

[15]张文娟，刘薇，魏锋，等.聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法用于检定川贝母掺伪情况的研究[J].药物分析杂志，2014，34（10）：1830-1835．

[16]Yao H，Song J，Liu C，et al.Use of ITS2 region as the uninversal DNA barcode for plants and animals[J].PLoS One，2010，5（10）：e13102．

[17]Li DZ，Gao LM.Comparative analysis of a large dataset indicates thatinternal transcribed spacer（ITS）should be incorporatedinto the core barcode for seed plants[A]//Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America[C].2011，108（49）：19641-19646．

[18]国家药典委员会.中国药典[M].四部.北京：中国医药科技出版社，2015：383-385.

Technical essentials for molecular biological method on identification of Fritillaria cirrhosa and its decoction pieces

[Abstract]TraditionalChinese Medicine is traditional medicine of china,which has extensive use in clinic treatment and daily health-care.The quality of Chinese medicinal materials and Traditional Chinese Medicine decoction pieces relates greatly to the clinical curative effect and security,which is also very important to the development of Traditional Chinese Medicine property.The identification of Chinese medicinal materials and Chinese medicinal decoction pieces is a focal point in traditional Chinese medicines profession,with the development of life science and technology leap,a variety of molecular biology technology is gradually used in medicinal plants and animals and the base source identification of Chinese Medicinal Materials,achieved good results.The"Pharmacopoeia of the People′s Republic of China" since 2010,contains the Chinese medicinal materials and medicinal slices(e.g,Agkistrodon,wu pin snakes and Fritillaria cirrhosa)molecular biology method,is to adopt new technology,new method to control the quality of traditional Chinese medicine.Standard has been four years,but brother units generally reflect the various technical problems encountered in the inspection process,it can′t solve.Identification based on the molecular biology of Fritillaria cirrhosa,for example,by summing up the main points that need to pay attention to the process of technology and common problems,aiming at will or are engaged in the inspection work colleagues to provide experience for reference,so that more efficient to complete the experiment successfully.

[Key words]Molecular biology;Fritillaria cirrhosa;Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism

[中图分类号]R917

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）02（c）-0092-04

（收稿日期：2016-12-18 本文编辑：顾雪菲）

[作者简介]闫海霞（1981-），女，博士研究生，主管药师，研究方向：中药质量控制

YAN Hai-xia TAN Cheng DU Xiao-weiCHEN You-gen FU Xin-tong▲

Department of Traditional Chinese Materials,Beijing Institute for Drug Control（Beijing Center for Health Food and Cosmetic Control）,Beijing 102206,China