何 骁1邓莉莉2

1.湖南省郴州市第一人民医院骨科，湖南郴州423000；2.湖南省郴州市第一人民医院儿科，湖南郴州423000

[摘要]目的观察兔自体骨髓基质细胞作为种子细胞移植修复兔坐骨神经长距离缺损的能力及其安全性，探讨骨髓基质细胞在坐骨神经损伤模型内分化为神经元样细胞的可行性。方法兔骨髓基质细胞分离培养、诱导、鉴定以及传代后注入坐骨神经损伤的兔模型中，并于细胞移植后第1、2、4、8及16周分别行透射电镜及免疫组化等方法观察。结果移植侧与对照侧神经纤维均有不同程度再生，但对照侧较移植侧神经纤维数量明显减少（t=175.88，P＜0.01）。结论BMCSs移植能促进兔坐骨神经功能障碍的恢复，并与本身相容性良好，为细胞替代疗法提供了乐观的应用前景。

[关键词]骨髓基质细胞；细胞培养；自体移植；坐骨神经

长距离周围神经缺损的传统治疗方法是自体神经移植，但此治疗方式存在严重缺陷，如为获取供体而导致的其他功能损害。目前干细胞的研究已逐渐深入，关于骨髓基质细胞（bone marrow stormal cells，BMSCs）自体移植修复长距离神经系统损伤的研究也越来越多，并逐渐成为热点[1]。作为自身组织，骨髓具有来源丰富、取材容易、高分裂增殖性、多组织分化潜能及不受免疫排斥等优点，这为细胞移植疗法提供了乐观的应用前景[2]。

本研究旨在识别、跟踪移植后BMSCs的存活状态及与宿主神经组织整合情况，最终为其进一步行体内自体移植治疗的实验应用奠定基础。

1.1 材料

选取体重为1.5～2.0 kg、约3月龄的新西兰兔（New Zealand Rabite）10只，均由南华大学动物中心提供。

1.2 试剂

白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、兔神经巢蛋白（nestin）抗体由Santa Cruz公司提供；FITC标记山羊抗小鼠IgG、生物素标记山羊抗小鼠IgG试剂盒均由Chemicon公司提供；碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）由R&D公司提供；PKH67染料试剂盒、3，3-二氨基苯联胺试剂盒（3，3-diaminobenzidinetetrahydrochloride，DAB）、细胞表皮因子（epidermal growth factor，EGF）、淋巴细胞分离液（percoll）、鼠抗单克隆神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体均由Sigma公司提供；神经干细胞培养基来自于南方医科大学实验室，专利号为02134314.4。

1.3 主要器材

组织剪、弯钳、有齿镊、血管钳、显微器械1套、缝针、无菌缝线、注射器、无菌操作台等。

1.4 实验步骤

1.4.1 骨髓采集、BMSC的分离、扩增及体外诱导于兔耳缘静脉将10%水合氯醛注入致其麻醉后，在无菌操作台上抽取股骨远端骨髓约4 ml。所获取的骨髓用Hank液稀释，细胞悬液与淋巴细胞分离液按1∶2比例混合，2500 r/min梯度离心15 min。将含核细胞的界面层吸出，加入1～2 ml双蒸水吹打，加入干细胞培养基，800 r/min离心约5 min，去除上清后加相同培养基，并加10%胎牛血清接种于培养板和培养瓶中（图1）。收集第三代细胞胞悬液加入本实验室配制的神经干细胞培养液及EGF（10 ng/ml）＋LIF（10 ng/ml）＋b-FGF（10 ng/ml）＋FBS（1%终浓度），接种于24孔培养板和培养瓶中，培养5 d（图2）。

1.4.2 兔坐骨神经损伤模型的制作兔称重从耳缘静脉注入10%水合氯醛致麻醉后，于双侧髋部消毒，置于无菌台并铺手术单。行髋关节后入路，依次切开皮肤、皮下、浅深筋膜，仔细止血，弯钳钝性分离臀大肌，显露坐骨神经分叉处。在分叉上方切开神经外膜，切除约8 mm长神经。用微量注射器吸取神经干细胞并注入神经缺损区内，缝合神经外膜及肌膜以加强对移植干细胞的包裹力。对照侧注射DMEM培养液。移植侧及对照侧随机选择，最后用明胶海绵包裹，在皮肤外标记实验组移植侧。将兔放入清洁笼具，预防感染，观察生命体征。1.4.3免疫组化染色取细胞移植手术成功后1、2、4、8、16周的实验新西兰兔各2只，采用1%戊巴比妥钠以100 mg/kg注射入腹腔后麻醉。消毒后打开胸腔，暴露心脏，导管插入左心室，生理盐水快速冲洗，将4%多聚甲醛由插管处（pH7.4）灌注500 ml固定，由原切口切开皮肤皮下并暴露、剥离含移植干细胞段的坐骨神经。

将剥离的兔坐骨神经依次移入10%～30%蔗糖（0.1 mol/L PB配制）溶液梯度浸泡，标本下沉后进行冰冻切片，片厚12 μm，贴于载玻片上。切片先进行常规普鲁士蓝染色，从中选择细胞形态较好的切片再进行抗S-100免疫组织化学法染色及DAB-H2O2棕色法染色。1.4.4透射电镜样品制备将移植端坐骨神经切片，片厚50 μm，显微镜观察后选取切片，用1%四氧化锇固定30 min，50%～95%梯度乙醇脱水，环氧丙烷置换，包埋及渗透，纯包埋剂（Epon 812）浸透过夜，聚合（37℃12 h、45℃12 h、60℃12 h）。对含移植细胞的纹状体区域在体视显微镜下进行超薄切片，片厚50 nm左右，由2%醋酸双氧铀（10 min）和枸橼酸铅（3 min）双重染色后在电子显微镜下观察，并进行拍照记录。

1.5 统计学处理

采用SPSS 15.0统计软件处理对照侧、移植侧各组织神经纤维数量（各取6张切片，每张切片选8点统计纤维条数），计量资料以均数±标准差（±s）表示，统计方法为配对t检验，α水平为0.05。

2.1 染色观察

通过HE染色对组织进行观察，各只兔移植侧与对照侧神经纤维均有不同程度再生，但对照侧神经纤维稀疏，较移植侧神经纤维数量明显减少，切片见明显的神经不连续，基质黏液变较移植侧改变明显（图3）。移植侧神经纤维较对照侧明显增多，且排列较整齐。术后4周和8周，移植侧形态上无显著差别；移植后16周神经纤维有序排列，S-100免疫组化染色可见施万细胞核均匀分散在神经纤维及神经束之间（图4）。移植治疗侧神经纤维数量为2126.63±23.76，高于对照侧的914.13±19.65，差异有统计学意义（t=175.88，P＜0.01）。

2.2 透射电镜检查

透射电镜下观察，移植后8周内在宿主坐骨神经缺损处神经样细胞与移植细胞之间未观察到有明显突触样结构，但移植16周标本可见移植细胞的突起伸向宿主施万细胞突起或胶质突起，两者之间可见少量突触形成（图5）。

在临床治疗中，周围神经损伤是一类残疾率高、治疗困难的疾病[3]，临床上再生修复效果常不理想[4-5]，这不仅给社会带来沉重的负担，同样给家庭带来了巨大痛苦。作为一种治疗神经系统损伤的方法，细胞移植开辟了一条的新途径[1,6-7]。2007年1月，Hu等[8]提取恒河猴自体BMSCs移植在尺神经缺损处，并与自体神经移植进行比较，结果显示，BMSCs移植与自体神经移植术后神经恢复效果相当，这为BMSCs用来修复动物周围神经损伤提供了有力的证据。

BMSCs是成体干细胞，与其他干细胞相比有显著优越性[9]。由于BMSCs具有来源广泛、强大的再生及分化潜能，且移植后体内排斥反应弱，并可以在诱导及相应环境下分化出神经元和神经胶质细胞等优点[10-13]，因此，BMSCs移植治疗神经损伤一直是人们探索的目标。2006年6月，Hou等[14]先在体外将BMSCs诱导分化，然后将分化后的MSC插入导管中来桥接大鼠坐骨神经损伤，手术后3个月显示，移植组桥接管内MSC在组织学上具有较完整的再生神经结构，复合肌动作电位（CMAP）的波幅、再生神经组织百分比、有髓神经纤维密度、轴突平均直径、髓鞘厚度等参数均高于未移植BMSCs的对照组，并在神经移植物远端观察到大量S100和NF阳性的神经纤维。2013年9月，Salomone等[15]将诱导、培养的BMSCs移植到面神经损伤的大鼠实验模型，在观察12周后进行CMAP测量及组织学评价，结果显示，移植组再生神经的传导速度有了明显改善，CMAP波幅有了明显升高；显微镜下观察发现大量的再生轴突。经过以上实验研究发现，BMSCs与周围神经有着及密切的关系[16-18]。

通过本实验观察到：①分离的BMSCs在体外培养3～4 d后能够迅速贴壁生长，贴壁后细胞形态为有多个突触的梭形或多角形，随后细胞开始分裂增殖，表现出克隆生长的特性。通过传代培养可去除非黏附细胞，这些细胞有可持续培养增殖的能力，提示BMSCs具有很强的再生能力。②在持续诱导、培养中发现，分离、诱导的BMSCs可形成细胞克隆团，并逐渐出现出芽现象，由此形成细胞胞突，并彼此发生联系，最终突起伸长连接成网状结构，呈典型的神经细胞形态。该结果提示BMSCs具有分化为组织细胞的潜能。③2014年，Mohammadi等[19]取大鼠的BMSCs进行体外培养、扩增并标记，移植入坐骨神经损伤的大鼠模型中，对照组移植磷酸缓冲盐水，手术后4、8、12周观察大鼠行为及形态组织学，结果显示，再生纤维的形态定量分析显移植侧的纤维数量和直径均显著高于对照组。本实验也观察到自体骨髓源性神经干细胞移植兔坐骨神经缺损有利于神经纤维的修复，对照组比自体移植组神经纤维生长有明显差异，自体移植组明显优于对照组。

综上所述，兔骨髓基质源神经干细胞移植后，可在自体坐骨神经内存活、迁移、分化，且无明显排斥反应。

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Research on bone marrow stromal cells autotransplantation into rabbit′s sciatic nerve

HE Xiao1DENG Li-li2
1.Department of Orthopedics,the First People′s Hospital of Chenzhou City in Hunan Province,Chenzhou423000,China;2.Department of Paediatrics,the First People′s Hospital of Chenzhou City in Hunan Province,Chenzhou423000, China

[Abstract]Objective To observe the ability and safety of autologous bone marrow stromal cells(BMSCs)as seed cells in repairing long distance defect of sciatic nerve in rabbits,and to explore the feasibility of BMSCs differentiating into neuron-like cells in sciatic nerve injury model.Methods BMSCs were injected into rabbit model of sciatic nerve injury, after isolated,cultured,induced,and identificated.Then electron microscope and immunohistochemisty were performed at the 1st,2nd,4th,8thand 16thweeks after cell transplantation.Results After transplantation,there were different degrees of regenerated nerve fibers between transplanted side and controlled side,but the number of nerve fibers was significantly reduced in control group,compared with the transplantation group(t=175.88,P＜0.01).Conclusion BMCSs transplantation has a well compatibility,which can promote the recovery of rabbit sciatic nerve dysfunction and provide an optimistic application prospect for cell replacement therapy.

[Key words]Bone marrow stromal cell;Cell culture;Autotransplantation;Sciatic nerve

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2017）01（c）-0013-04

（收稿日期：2016-11-01本文编辑：祁海文）

[作者简介]何骁（1982-），男，湖南郴州人，硕士，主治医师，主要从事关节、创伤相关疾病的研究