张鸿晖 谢斌辉▲

赣南医学院第一附属医院急诊外科，江西赣州 341000

[摘要]目的研究构建可以稳定表达HBx和MicroRNA-21基因的肝卵圆细胞株的方法。方法采用LE培养基培养大鼠卵圆细胞株（LE/6），以质粒PcDNA3.1-HBVx中的HBVx序列为模板，PCR法扩增得到目的基因片段A。将HBx目的基因片段和质粒载体pEGFP-Nl进行双酶切，线性化得到重组质粒命名为pEGFP-HBx。重组质粒转化感受态大肠埃希菌DH5a，并进行筛选培养。用脂质体法将质粒转染卵圆细胞，作为pEGFP-HBx组；用脂质体法将质粒转染质粒载体pEGFP-Nl，作为pEGFP-NI质粒组。最后将Pre-MicroRNA-21与HBx-LE/6共培养，培养24 h后用荧光显微镜观察转染细胞的荧光表达情况。结果pEGFP-HBx中GFP表达量经荧光定量PCR仪器确定为92.28%，且表达程度强；Pre-MicroRNA-21与HBx-LE/6共培养完成后，pEGFP-HBx组内MicroRNA-21的转录水平经仪器测量为1.77±0.24，显著高于pEGFP-NI质粒组内的0.36±0.21，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论本研究成功地构建了稳定表达HBx和MicroRNA-21基因肝卵圆细胞株，为进一步研究HBx蛋白、miRNA-21、肝卵圆细胞与肝癌之间的关系提供了实验基础。

[关键词]HBx；MicroRNA-21基因；肝卵圆细胞；大肠埃希菌DH5a；质粒载体pEGFP-N l

乙型肝炎病毒（HBV）感染是原发性肝癌（肝癌）的重要危险因素，HBV基因结构中包括S、C、P与X 4个开放阅读框，可起到反转录激活作用，激活大部分的病毒与肿瘤基因，直接作用于肝癌的发生、发展，而MicroRNA属于内源性非编码小RNA，影响肿瘤的发生、发展[1-2]。近来有研究表明，在多种肿瘤中发现了肿瘤干细胞的存在，而且已被证明这些肿瘤干细胞在肿瘤中发挥重要作用，而干细胞也具有肿瘤干细胞类似的特性[3-4]，这些研究结果提示，肿瘤有可能来源于肿瘤干细胞。肝卵圆细胞被认为是人体肝内的干细胞，其特性与肿瘤干细胞极其相似，而且有研究表明肝卵圆细胞以及HBx蛋白可成为肝癌治疗和预防的靶细胞和靶基因，MicroRNA-21能够成为新的肝癌基因治疗的靶分子[5]。鉴于此，为了更好地研究肿瘤血管生成，肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭等，我院构建了稳定表达HBx和MicroRNA-21基因的肝卵圆细胞株，现报道如下。

1.1 一般资料

从实验鼠身上提取肝卵圆细胞LE/6细胞，我院科研中心构建并保存pcDNA3.1-HBx质粒和真核表达载体pEGFP-N1。实验所需试剂均从国内上海生工生物工程公司合成购买。从日本Takara公司购进限制性内切酶Hin dⅢ和KpnⅠ。我院科研中心拥有CO2细胞恒温培养箱（英国GalaxyS）、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、实时荧光定量PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）、荧光分析仪（美国Beckman公司）、低温高速冷冻离心机（美国Sigma公司）、超低温冰箱（青岛Haier公司）、流式细胞仪（美国BD公司）、双向电泳仪（北京生化仪器厂）、核酸蛋白检测仪（南京大学普阳科学仪器研究所）、超纯水仪（Millipore公司）、凝胶成像系统（Gel Doc1000，美国BioRad公司）等一大批先进的进口仪器设备。

1.2 研究方法

培养肝卵圆细胞，主要步骤如下。将大鼠卵圆细胞株（LE/6）采用用LE培养基进行培养：培养基成分包括10%的FBS，胰岛素浓度为1μg/ml，氢化可的松浓度为0.5μg/ml，庆大霉素浓度为25μg/ml。再给培养基中加入淋巴细胞抑制因子（LIF），使最终培养液中LIF的浓度为1000 IU/ml；将培养基放入培养箱中，要求培养箱温度为37℃，CO2浓度为5%，每72小时传代1次。利用胰蛋白酶消化细胞将培养基中细胞接种于6孔板中，等到细胞生长汇合达70%～80%时即可进行转染。

构建稳定、高效表达HBx蛋白和MicroRNA-21的肝卵圆细胞株，其具体做法如下。①获得相应的目的基因：以质粒PcDNA3.1-HBVx中的HBVx序列为模板，通过PCR扩增仪筛选出目的基因片段A。根据GeneBank中HBVx序列，设计引物，并在引物下游部分分别引入限制性酶切位点Hin dⅢ和KpnⅠ。②构建重组质粒：建立双酶切的反应体系，将目的基因A和质粒载体pEGFP-Nl进行双酶切，线性化得重组质粒命名为pEGFP-HBx。③质粒转化：重组质粒转化感受态大肠埃希菌DH5a，并进行筛选培养。④将质粒转染卵圆细胞（pEGFP-HBx组）：按阳离子脂质体试剂盒上的说明书制作Lipofectin/DNA混合物，方法：往250μl无血清培养基（OPTI－MEM）中加入10μg阳离子脂质体，混匀，在常温下放置5 min；然后往250μl无血清培养基（OPTI－MEM）中投放4μg质粒并且混匀。接着把质粒溶液加入阳离子脂质体培养基混合溶液内，轻轻混匀，在常温下放置30 min，备用。用PBS清洗细胞后，将包裹好的Lipofectin/DNA加入细胞培养皿，要求温度37℃，CO2浓度为5%、温育5 h后，弃去转染液，换含血清的LE培养基继续培养。同时转染pEGFP-NI作为pEGFP-NI质粒组。⑤将Pre-MicroRNA-21与HBx-LE/6共培养。获得的稳定表达MicroRNA-21与HBx细胞株见图1。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件分析，计量资料以s表示，符合正态分布，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 两组受转染细胞荧光蛋白表达量的比较

pEGFP-HBx和pEGFP-NI质粒在限制性内切酶酶切后，进行电泳后，pEGFP-HBx组中GFP表达量经荧光定量PCR仪器确定为92.28%，表达程度强，pEGFP-NI组中GFP表达量在35.14%，表达程度弱，差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。图2为转染pEGFP-HBx基因后，LE/6细胞形态的变化，由之前的卵圆形变为短梭形。

2.2 两组受转染细胞Pre-M icroRNA-21质粒检查结果的比较

Pre-MicroRNA-21与HBx-LE/6各10组共培养，培养完成经电泳后，pEGFP-HBx组内MicroRNA-21的转录水平经仪器测量结果为1.77±0.24，显著高于pEGFP-NI质粒组内的0.36±0.21，差异有统计学意义（t=13.982，P＜0.05）。

HBV感染是肝癌的一个主要原因，肝癌患者中有80%以上的患者都携带HBV。HBx是一个多功能蛋白，作为反式激活因子对HBV复制具有调节作用，同时参与细胞多种信号的转导以及一些信号通路调节细胞的增殖与转化[6-7]，最主要的是该蛋白可对Wnt/ β-catenin信号途径起正向调节作用[8]。卵圆细胞被认为是成体肝内的干细胞，一般见于小叶间胆管，数量极少，具有自我更新、自我增殖和多向性分化的能力，这些特性与肿瘤干细胞非常相似[9-10]。HBx蛋白是一种癌蛋白，很多学者认为该蛋白在肝癌发病过程中有一定的作用[11]。研究表明，HBx基因在卵圆细胞中的整合率高达85%，这与其在肝硬化和肝癌组织的整合率一致，因此肝卵圆细胞以及HBx也被肝病专家认为可以作为肝癌治疗和预防的靶细胞和靶基因[12-13]。

MicroRNA-21是一种具有自主转录单位的miRNA，并在多种肿瘤细胞中出现显著的异常表达，且参与调控多种抑癌基因的表达，提示miRNA-21作为一个致癌miRNA，在多种肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，并被认为是能够成为新的肝癌基因治疗的靶分子[14-15]。

在本研究中，通过构建稳定表达HBx和MicroRNA-21基因的肝卵圆细胞株，pEGFP-HBx和pEGFP-NI质粒在限制性内切酶酶切后，pEGFP-HBx中GFP表达量经荧光定量PCR仪器确定为92.28%，且表达程度强，显著优于pEGFP-NI质粒，而且成功地将Pre-MicroRNA-21与HBx-LE/6进行共培培养，pEGFP-HBx组内MicroRNA-21的转录水平经仪器测量为1.77± 0.24，显著高于pEGFP-NI质粒组内的0.36±0.21，这些数据均表示稳定表达HBx和miRNA-21基因的肝卵圆细胞株构建成功。

综上所述，本研究成功构建了可以稳定表达HBx 和MicroRNA-21基因的肝卵圆细胞株，为进一步研究HBx蛋白、miRNA-21、肝卵圆细胞与肝癌之间的关系提供了实验基础。

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Experimental study on the construction of hepatic oval cell strain stably expressing HBx and M icroRNA-21 gene

ZHANG Hong-hui XIE Bin-hui▲
Departmentof Emergency Surgery,the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College in Jiangxi Province,Ganzhou 341000,China

[Abstract]ObjectiveTo study the constructionmethod of stably expressing HBx and MicroRNA-21 gene of hepatic oval cell strain.MethodsOval cell strain (LE/6)in rat was cultured using LE culture medium,and HBVx sequence in plasmid of PcDNA3.1-HBVx was used as the template,and target gene fragment A was obtained by PCR method amplification.HBx target gene fragment and plasmid vector pEGFP-Nl were conducted double enzyme digestion,and the recombinant plasmid obtained by linearization was named as pEGFP-HBx.Competence of Escherichia coli DH5a was transformed by recombinant plasmid to conduct screening and culture.The plasmid was transfected into oval cells by liposome method (the pEGFP-HBx group)while plasmid vector pEGFP-Nl was transfected by liposome method(the pEGFP-NIplasmid group).Finally,Pre-MicroRNA-21 and HBx-LE/6were given co-culture,and after 24 h culture,fluorescence expression of transfected cellwas observed by fluorescencemicroscopy.ResultsThe expression volume of GFP in pEGFP-HBx determined by fluorescence quantitative PCR instrumentwas 92.28%,with strong expression degree.After the co-culture of Pre-MicroRNA-21 and HBx-LE/6 was completed,the transcription level of MicroRNA-21 in pEGFPHBx groupmeasured by instrumentwas(1.77±0.24),and itwassignificantly higher than thatin the pEGFP-NIplasmid group (0.36±0.21),and differences between the two groupswas statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe stable expression of HBx and MicroRNA-21 gene in hepatic oval cell strain is successfully constructed,which provides the experimental basis for further study on the relationship between HBx protein,miRNA-21,hepatic oval cells and liver cancer.

[Keywords]HBx;MicroRNA-21 gene;Hepatic oval cell;Escherichia coli DH5a;Plasmid vector pEGFP-Nl

[中图分类号]R735.7

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2016）12（a）-0004-04

（收稿日期：2016-09-25本文编辑：许俊琴）

[基金项目]江西省自然科学基金资助项目（2012ZBAB205001）；江西省科技厅支撑计划项目（20112BBG70037）；江西省赣州市指导性科技计划任务（2011）

[作者简介]张鸿晖（1980-），男，江西赣州人，本科，主治医师，研究方向：肝胆疾病的诊治

▲通讯作者：谢斌辉（1974-），男，江西赣州人，博士，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：肝胆疾病的诊治