刘大维

辽宁省锦州市疾病预防控制中心微生物检验科，辽宁锦州121000

[摘要]目的探讨我国H7N9禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因的分子进化情况。方法通过2013年1月～2015年11月不同途径公布的人感染H7N9禽流感病例资料，分析我国H7N9禽流感病毒流行病学特点，筛选H7N9禽流感病毒株的核酸序列和氨基酸序列，分析核苷酸及所编码关键位点情况。结果国内病毒株同源性得分＞0.99，从神经氨酸酶基因同源性分析中，广东第1例H7N9禽流感的神经氨酸酶基因KF662949和山东的H7N9禽流感的神经氨酸酶基因CY147110、浙江的H7N9禽流感的神经氨酸酶基因KF500926具有较高的同源性，其中KF662949和CY147110同源性得分达到0.999。血凝素氨基酸序列裂解位点和潜在糖基化位点分别为30、46、249、421、493，神经氨酸酶氨基酸序列耐药位点和潜在的糖基化位点主要包括神经氨酸酶119R、120E、152D、153R、200N、226R、229E、245D、276H、278E、279E、294R、332D、351K、427E。结论H7N9禽流感毒株在时间和空间方面有一定的聚集性，时间越近、空间距离越短，可能出现进化关系越发接近。

[关键词]H7N9；禽流感病毒；流行病学；血凝素；神经氨酸酶

2013年2月我国发现首例的人感染H7N9禽流感病例，3月中国疾病预防控制中心证实公布3例新型人感染H7N9型禽流感确诊病例，从此H7N9禽流感快速蔓延，患者多数以高热、咳嗽、咳痰等流感症状作为临床表现，快速发展成为重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征，死亡率＞30%[1-2]。目前为止世界范围内禽类感染甲型流感H7亚型中，H7N7、H7N2、H7N3流感病毒均出现过感染人类的现象，但是H7N9流感病毒只是在禽类中被检测到[3-4]。H7N9禽流感病毒属于甲型流感病毒，其宿主的范围比较广泛，主要有哺乳动物、禽类和爬行动物，不同的甲型流感病毒可以通过抗原漂移和抗原转换重配，形成新的流感病毒并且逐步地

传播给其他动物，另外动物宿主也有一定的比例导致病毒在人群以外持续性地循环传播，并且不排除H7N9发生分子变异，逐步适应人体宿主从而引起大规模暴发流行的可能性[5-6]。因而把握好H7N9禽流感流行病学特点，认识H7N9分子进化规律，对于防控H7N9禽流感具有重要的价值[7-8]。本研究通过对我国各个地区H7N9流行病学特点、血凝素和神经氨酸酶变化情况进行分析，以探讨H7N9禽流感有效的防控措施，现报道如下。

1.1 一般资料

收集我国2013年1月～2015年11月国家卫生计生委、世界卫生组织和Flutrackers论坛发布的病例资料，对H7N9流行病学特点进行分析。目前资料显示，到2014年7月为止，我国有人感染H7N9禽流感病例451例，其中有90例死亡，死亡率达19.96%，男性310例，女性病例数138例，另外有3例性别调查不详，男女性别比例为2.25∶1；年龄0～90岁，其中＞60岁病例数占全部病例的45.7%，＞60岁死亡病例数占全部死亡病例数的60.2%。

1.2 方法

利用Clusta X2.1进行核酸序列对比，将序列长度进行修剪，通过MEGA5.0构建分子进化树，采用neighbor-joining法。通过软件Bioedit，在Alignment下进行SequenceⅠndentity Matrix对矩阵进行构建，分析序列之间的同源性情况。通过软件Bioedit，在Clusta W程序下，对不同区域和来源的新型甲型H7N9毒株氨基酸序列进行对比，分析毒力的位点和耐药性的位点变异规律。通过Net NGlyc 1.0 server糖基化位点预测器，对可能存在的糖基化位点氨基酸序列进行分析。

2.1 血凝素和神经氨酸酶基因进化和同源性分析

国内病毒株彼此之间同源性得分＞0.990，但是美洲的4个病毒株和国内病毒株的同源性得分最高仅为0.762。从神经氨酸酶基因同源性分析中，广东第1例H7N9禽流感的NA基因KF662949和山东发现的H7N9禽流感的NA基因CY147110、浙江发现的H7N9禽流感的NA基因KF500926具有较高的同源性，其中KF662949和和同源性得分达到0.999。

2.2 血凝素和神经氨酸酶氨基酸序列分析

血凝素氨基酸序列裂解位点和潜在糖基化位点分别为30、46、249、421、493，此位点和2009年发现的H7N9病毒株比较，无明显变化（图1）。

神经氨酸酶氨基酸序列耐药位点和潜在的糖基化位点主要包括神经氨酸酶119R、120E、152D、153R、200N、226R、229E、245D、276H、278E、279E、294R、332D、351K、427E，对上述位点进行多个序列比对，未发现存在耐药性突变。神经氨酸酶氨基酸糖基化位点包括42、52、63、66、87、147、202，除KF034913和神经氨酸酶缺失52位的糖基化位点以外，其他的位点都没有发生变化（图2）。

2013年2月我国出现流行的人感染H7N9禽流感，目前已经造成数百人感染，男女性别比例较H5N1亚型流感有明显升高，感染患者的年龄呈现负偏态型分布，＞60岁患者和男性比例较高，而H5N1亚型流感则集中在10～30岁年龄段的人群[9]。目前H7N9禽流感病毒已经造成近百人死亡，死亡率接近20%，但是仍然低于H5N1型禽流感病毒[10]。感染患者呈现快速增长，目前对于H7N9禽流感流行病学研究相对较少，可能是由于H7N9禽流感临床症状不明显造成的[11]。人感染H7N9禽流感病例发病地区主要集中在沿海地区，其中浙江省发生例数最多为139例，广东省次之为113例，江苏省59例，上海市39例，东北地区、西南地区比较少见，2014、2015年迎来两次高峰，发病月份多集中在1月，2月份开始呈现逐步降低的趋势。H7N9禽流感多发生于冬春季，目前H7N9禽流感没有人人传播，但是动物模型上发现A/Anhui/1/2013毒株有接触性传播，因而不能排除H7N9禽流感病例仅发生在我国沿海地区的可能性，长江三角洲和珠江三角洲疫情比较严重。同时H7N9禽流感城镇人口的比例明显大于H5N1，说明H7N9禽流感的流行可能和人口密度高、禽类消费程度大有着密切的关系。

血凝素和神经氨酸酶属于流感病毒膜表面蛋白，血凝素会促使病毒颗粒在敏感细胞表面的唾液酸受体吸附，造成感染；神经氨酸酶有一定的水解唾液酸活性，在禽流感病毒脱离宿主细胞后，通过神经氨酸酶水解和血凝素结合低聚糖侧链末端唾液酸，促进病毒从感染细胞释放、扩散[12]。另外，血凝素和神经氨酸

酶属于流感病毒抗原性主要部位，点突变引起抗原漂移、8个节段基因，从而诱发抗原发生转移，形成了流感大流行的遗传学基础。神经氨酸酶还是抗流感药物作用的靶点之一，其发生改变会造成耐药性发生[13]。目前我国H7N9禽流感病毒株位于同一个分支，其和其他国家毒株比较，进化距离较近，发现一些和分离时间越近的毒株，其同源的可能性越大，H7N9禽流感病毒株在同地区、同一时间段表现出更加高的同源性。

通过National Center of BiotechnologyⅠnformation上下载的24条血凝素序列和22条神经氨酸酶序列分别进行进化树的构建，目前世界范围内的H7N9禽流感病毒主要分为两支，其中一支来源于美洲，主要包括危地马拉和美国，另外一支来源于欧亚，主要包括西班牙、瑞典、蒙古、中国、韩国和日本，我国的17条H7N9病毒株位于同一个分支，但是2013～2014年分离的KF922737、KJ023067、KF662943和KJ023074有很近的进化关系[14]。

神经氨酸酶同源性分析结果表明，我国广东省第1例H7N9禽流感病毒神经氨酸酶基因KF662949和山东省H7N9禽流感病毒神经氨酸酶基因CY147110、浙江省H7N9禽流感病毒神经氨酸酶基因KF5009226的同源性得分比较高，其中KF662949和CY147110同源性得分为0.999，和上海麻雀分离的KF609529同源性得分为1.000，提示可能是由于候鸟迁徙的过程中，将禽流感病毒传播到广东地区，广东地区的禽流感病毒在秋季感染人，造成感染病例数明显升高。

宿主蛋白酶可以促使甲型流感病毒血凝素裂解为血凝素1和血凝素2，血凝素1可以和宿主细胞受体结合，血凝素2属于参与和细胞膜融合的重要亚单位，如果血凝素容易被切割，则提示病毒株具有较高的致病力。相关资料显示，高致病力毒株的血凝素在裂解位点附近有多个碱性氨基酸，然而低致病力毒株的血凝素在裂解位点只有一个精氨酸，最多≤2个碱性氨基酸，这些都说明血凝素酶切位点如果发生变异则会影响禽流感病毒毒力[15]。H7N9禽流感裂解位点都是PEⅠPKGR↓GLF，其含有两个碱性氨基酸，因而其具有较低致病性。血凝素和神经氨酸酶均属于禽流感病毒表面重要的糖基化蛋白，血凝素和神经氨酸酶在各种亚型甲型流感病毒内均有保守的糖基化位点，神经氨酸酶是因不同亚型伴有不同的缺失，在糖基化位点上的数目表现出不同，一般情况下保守的糖基化位点是2～4个。有资料显示，KF034913的神经氨酸酶缺少了52位糖基化位点，感染此毒株的是一个重症患者，在2013年4月24日死亡，这个位点突变可能会造成H7N9致病性增强，进而影响临床治愈效果[16]。

综上所述，H7N9禽流感毒株在时间和空间方面有一定的聚集性，时间越近、空间距离越短，可能出现的进化关系越发接近。

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The molecular evolution analyzing of hemagglutinin and neuraminidase gene for H7N9 avian influenza virus in our country

LIU Da-wei
Microbiology Laboratory,Center for Disease Control and Prevention of Jinzhou City in Liaoning Province,Jinzhou 121000,China

[Abstract]Objective To explore molecular evolution analyzing of hemagglutinin and neuraminidase gene for H7N9 avian influenza virus in our country.Methods The medical records of human infection H7N9 avian influenza virus for different ways publishing,the epidemiology feature for H7N9 avian influenza virus in our country from January 2013 to November 2015 were analyzed,the nucleotide sequence and amino acid sequence of H7N9 avian influenza virus viral strain were selected,nucleotide and coding key sites were analyzed.Results Homologous points of viral strain inland were greater than 0.99,from neuraminidase gene were homology analyzed,neuraminidase gene KF662949 of the first H7N9 avian influenza virus in Guangdong and neuraminidase gene CY147110 of avian influenza virus in Shandong, neuraminidase gene KF500926 of avian influenza virus in Zhejiang were higher homology,KF662949 and CY147110 homology score was 0.999.Amino acid sequence cracking site and potential glycosylation sites of hemagglutinin was 30,46,249,421,493,Amino acid sequence resistance loci and potential glycosylation sites of neuraminidase was 119R, 120E,152D,153R,200N,226R,229E,245D,276H,278E,279E,294R,332D,351K,427E.Conclusion H7N9 avian influenza virus has a certain aggregation in time and space,with closer time,shorter distance,which has appeared more close evolutionary relationship.

[Key words]H7N9;Avian influenza virus;Epidemiology;Hemagglutinin;Neuraminidase

[中图分类号]R181.2+4

[文献标识码]A

[文章编号]1674-4721（2016）10（c）-0179-04

（收稿日期：2016-08-11本文编辑：方菊花）