高元妹1　徐　仲1　黄东健1　蔡绍曦2

1.广州医科大学附属第三医院重症医学科，广东广州　510150；2.南方医科大学南方医院呼吸科，广东广州　510515

［摘要］目的探讨不同处理因素对呼吸道合胞病毒（RSV）感染原代培养的人支气管上皮细胞（NHBE）表达血管内皮细胞生长因子（VEGF）的影响。方法通过荧光定量PCR、ELISA检测不同处理因素对RSV感染NHBE VEGF表达的影响。结果RSV感染NHBE后，NHBE对VEGF的表达明显增加，呈明显的时间依赖性和浓度依赖性，地塞米松可以显著抑制RSV感染NHBE细胞的VEGF表达，与RSV感染组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。25羟基维生素D3单独作用可以刺激NHBE细胞表达VEGF，但可以抑制RSV感染NHBE的VEGF表达，与RSV组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论RSV增加了NHBE对VEGF的表达，地塞米松和25羟基维生素D3可以减弱这种效应。

［关键词］支气管哮喘；呼吸道合胞病毒；血管内皮生长因子；支气管上皮；维生素D；地塞米松

支气管哮喘是一种以反复喘息为主要症状并受多种因素影响的慢性气道性炎症性疾病。目前认为，哮喘的主要病理生理学特征与气道炎症、气道高反应性和气道重塑相关。气道在环境激发因子的作用下，最先攻击的靶细胞是气道上皮，而气道上皮的损伤与气道炎症的发生发展密切相关，也是导致气道重塑、增加哮喘治疗难度的重要因素［1］。气道上皮的结构性破坏及持续存在的炎症反应是多种气道疾病尤其是哮喘的共同表现［2］。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）作为哮喘发生的潜在起始因子，已被人们关注多年。无论在儿童或成人，80%的哮喘急性发作与呼吸道病毒感染相关［3-4］。预防和治疗RSV感染以防治哮喘发作仍是当前的重要课题。血管内皮细胞生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）是在哮喘气道重塑中起关键作用的调节因子，与各种炎症细胞和炎症介质相互作用，参与哮喘的气道炎症、气道高反应性和气道重塑的形成［5］。本研究以原代培养的人支气管上皮细胞 （normal human bronchial epithelial cells，NHBE）作为研究对象，通过RSV感染NHBE，观察其对上皮细胞表达VEGF的影响，并分别以地塞米松和活性维生素D（25羟维生素D3）进行干预，观察其对RSV感染的气道上皮表达VEGF的影响。探讨RSV感染的机制与哮喘发生的关系，在RSV感染哮喘患者给予适当的干预治疗，减轻RSV感染后的气道炎症反应，为治疗和预防哮喘发作提供一定的理论依据和实验基础。

1.1　材料

RSV Long株由广州呼吸疾病研究所免费馈赠，支气管上皮细胞培养基（BEGM）购自美国Clonetic公司，25羟维生素D3购自美国Sigma公司，胎牛血清、MEM培养基、0.25%的胰酶购自美国Gibco公司，VEGF ELASA试剂盒购自美国R&D公司，DEPC水购自广州威佳生物技术公司，RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司，基因引物购于宝生物工程有限公司（大连Takara公司），细胞培养板购自美国康宁公司。

1.2　方法

1.2.1　RSV病毒的扩增和滴定 按之前的实验方法进行RSV病毒的扩增和滴定，储存于-80℃备用［6］。

1.2.2　NHBE的原代培养和鉴定　人的支气管上皮标本均来源于本院胸外科肺叶切除分离获取的正常支气管组织或纤支镜黏膜活检获取的正常支气管上皮。用组织贴块法［7］原代培养获取NHBE，3～5代细胞用于实验。用鼠抗人的角蛋白8抗体进行细胞免疫组化鉴定。

1.2.3　四唑盐（Methy ltetrazo lium，MTT）比色法检测不同浓度的25羟维生素D3对NHBE活力的影响 实验分组：0、5、10、20 nmol/L 25羟维生素D3，每组设6个复孔。按之前的实验方法进行MTT实验，最后在酶标仪上测定490 nm的吸光度值（D值）［6］。

1.2.4　real-time PCR、ELISA检测不同时间点、不同感染复数（multiplicity of in fection，MOI）RSV感染NHBE后对VEGF蛋白表达的影响 实验分组：阴性对照组，RSV MOI 0.005组，MOI 0.05组，MOI 0.5组，每组设3个复孔。将生长良好的NHBE 以5×106的密度接种于24孔细胞培养板中，细胞生长达90%融合，更换基础培养基（BEBM）培养12 h，不同MOI的RSV吸附NHBE 4 h，弃去培养基，更换BEBM培养36 h，收集细胞上清，5000 r/min离心10 min，留取细胞上清-80℃冻存，留待ELISA检测上清中VEGF的蛋白水平，同时提取细胞总RNA，用real-time PCR检测NHBE的VEGFmRNA表达［6］（按试剂盒说明书进行实验）。

1.2.5　按不同处理因素对RSV感染NHBE后对VEGF表达的影响实验分组 实验分组：阴性对照组，RSV组，25羟维生素D3组，RSV/25羟维生素D3组，地塞米松组，RSV/地塞米松组，每组设3个复孔。将生长良好的NHBE以5×106的密度接种于24孔细胞培养板中，细胞生长达90%融合，更换BEBM培养12 h。RSV/25羟维生素D3组，25羟维生素D3组，RSV/地塞米松组，地塞米松组，分别以含10 nmol/L 25羟维生素D3、0.01 mg/ml地塞米松的BEBM预处理12 h，阴性对照组和RSV组分别加同等量的BEBM处理相同时间，除了阴性对照组、25羟维生素D3组、地塞米松组，其余病毒组均加入MOI为0.5的RSV病毒液继续培养24 h。收集各组细胞上清，5000 r/min离心10 min，细胞上清-80℃冻存，ELISA检测上清中VEGF的蛋白水平（按试剂盒说明书进行实验）。

1.3　统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行单变量方差分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用t检验，组间多重比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1　人的支气管上皮细胞的培养和鉴定

镜下观察生长成单层的支气管上皮细胞呈铺路鹅卵石样分布生长，单个细胞呈扁平状，多边形，符合上皮细胞生长特征。细胞免疫组化见95%以上细胞胞浆呈棕黄色着色，胞浆内角蛋白染色阳性，证实为支气管上皮细胞。

2.2　MTT比色法检测不同浓度25羟维生素D3对细胞活力的影响

细胞活力=（处理组D值-空白组D值）/（对照组D值-空白组D值）×100%。结果显示，在25羟基维生素D3浓度≤10 nmol/L时，对细胞活力无明显影响，参考实验结果及文献数据，选择10 nmol/L浓度的25羟维生素D3处理细胞。

2.3　RSV感染NHBE后VEGF的表达增加

RSV感染NHBE后，VEGF的表达增加，且呈明显的浓度依赖性（图1）和时间依赖性（图2）。在MOI 0.5时最明显，选取MOI 0.5为最佳MOI，MOI 0.5感染24 h作用最明显，同对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）（图3），根据上述实验选用MOI 0.5，感染时间24 h作为RSV实验条件。

 

图1　不同MOI的RSV作用于NHBE对VEGFmRNA表达水平的影响

 

图2　RSV不同时间点作用于NHBE对VEGFmRNA表达水平的影响

 

图3　RSV不同时间点作用于NHBE对VEGF蛋白表达水平的影响

2.4　不同处理因素对RSV感染NHBE VEGF蛋白表达水平的影响

RSV感染NHBE后，VEGF的表达明显增加，地塞米松可以显著抑制RSV感染NHBE VEGF蛋白的表达，与RSV感染组比较差异有统计学意义 （P＜0.05）（图4）。25羟基维生素D3单独作用可以刺激NHBE表达VEGF蛋白，但可以抑制RSV感染NHBE 对VEGF蛋白的表达，与RSV组比较差异有统计学意义（P＜0.05）（图5）。

 

图4　地塞米松对RSV感染NHBE表达VEGF蛋白水平的影响

 

图5　活性维生素D对RSV感染NHBE表达VEGF蛋白水平的影响

VEGF是一个多功能的细胞因子，在免疫炎症反应中起重要作用，其增强血管通透性的作用是组胺的5000倍。VEGF在哮喘气道重塑、血管重塑中起关键作用，与各种炎症细胞和炎症介质相互作用，共同参与哮喘的气道炎症、气道高反应性和气道重塑的发生发展。相关研究显示，支气管哮喘患者无论是血中还是诱导痰中的VEGF水平均明显升高，与FEV1呈明显的负相关，与气道血管通透性及气道狭窄的程度呈明显的正相关，VEGF可以作为病情评估和疗效判定的一个指标［8-10］。Lee等［11］在转基因小鼠的动物实验中发现VEGF可以通过IL-13依赖途径和非IL-13依赖途径诱导小鼠产生类似哮喘的气道炎症、气道高反应性，促进气道重塑，还可以增强气道抗原的敏感性及Th2炎症反应。迄今为止，诸多研究证明VEGF在哮喘启动和维持中发挥着重要作用，VEGF的调节有望成为未来哮喘治疗的新靶点。在本研究中笔者发现，NHBE感染RSV后对VEGF的表达明显增加，地塞米松能有效抑制RSV感染引起的NHBE VEGF的合成，说明在病毒感染诱发的哮喘加重中激素可以通过抑制上皮细胞的VEGF表达来起作用。近年来，维生素D与哮喘的关系越来越受到人们的关注，但不同研究的结果尚不一致。流行病学调查发现，两者存在负相关，无论是儿童哮喘还是成人哮喘，维生素D含量越低，哮喘症状越重，妇女妊娠期间增加维生素D的摄入可减少儿童早期患哮喘的风险［12-13］。不同的实验却得到不同的结论，王晓芳等［14］在动物实验中发现在大鼠出生后早期补充维生素D，与对照组相比，无论低剂量组还是高剂量组均可促进哮喘的发生，加重气道炎症的病变程度，而高剂量组则更明显。对于具有免疫调控作用的维生素D究竟对哮喘的发生发展起利或弊的作用尚存在很大争议。本研究发现，维生素D单独作用可以使NHBE表达VEGF增加，这可能与维生素D激活了NHBE上的维生素D受体的启动子反应元件有关，从而使NHBE表达VEGF上调［15］。但本研究也发现维生素D可以抑制RSV感染后NHBE表达VEGF，这可能与维生素D本身可以减低NHBE的通透性、增强气道上皮的屏障作用有关［16］。此外，尽管维生素D本身无清除病毒的能力，但可以增加核转录因子-κB抑制剂——κB抑制蛋白α的生成，抑制了核转录因子下游炎症因子的表达，从而减轻RSV感染NHBE介导的炎症反应［17］。有关维生素D可以抑制RSV感染后的NHBE表达VEGF的机制尚需进一步研究和探讨。

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Im pact of different treatment factors on expression of vascular endothelial grow th factor in primary cultured human bronchial epithelial cells in-fected with respiratory virus

GAO Yuan-mei1XU Zhong1HUANG Dong-jian1CAIShao-xi2
1.Intensive Care Unit，the Third Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University in Guangdong Province，Guangzhou 510150，China；2.Department of Respiration，Nanfang Hospital Affiliated to Nanfang Medical University in Guangdong Province，Guangzhou　510515，China

[Abstract]Objective To explore the impact of different treatment factors on expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）in primary cultured nornal human bronchial epithelial cells（NHBE）infected with respiratory syncytial virus（RSV）.Methods The impact of different treatment factors on expression NHBE VEGF infected with RSV was tested by using fluorescence quantitative PCR and ELISA.Results After NHBE infected with RSV，the expression of NHBE VEGFwas significantly increased，and with obvious time dependence and concentration dependence，Dexamethasone could significantly inhibit expression of VEGF in NHBE infected with RSV，and the difference was statistically significant compared with RSV infection group　（P＜0.05）.25 hydroxy vitamin D3alone using could stimulate that NHBE expressed VEGF，but it could inhibit that NHBE infected with RSV expressed VEGF，and the difference was statistically significant compared with RSV infection group　（P＜0.05）.Conclusion RSV increases the expression of VEGF in bronchial epithelium，while Dexamethasone and 25 hydroxy vitamin D3can reduce this effect.

[Key words]Bronchial asthma；Respiratory virus；Vascular endothelial growth factor；Bronchial epithelium；Vitamin D；Dexamethasone

［中图分类号］R593.1

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）09（c）-0015-04

（收稿日期：2016-07-13本文编辑：方菊花）

［作者简介］高元妹（1975-），女，博士，副主任医师，研究方向：呼吸危重症