曾海松　俞洁东▲　邵秋红

扬子江药业集团有限公司中药研究院，江苏泰州　225321

［摘要］目的建立青乳消颗粒的质量标准。方法采用薄层色谱法对青乳消颗粒中的青皮、夏枯草、浙贝母、乳香进行定性鉴别；采用HPLC法对该制剂中的迷迭香酸进行含量测定。结果薄层鉴别专属性强、斑点清晰、分离度好、阴性对照无干扰、重现性良好；迷迭香酸在1.26～40.36μg/ml范围内线性关系良好（r=0.99995，n=6）；平均回收率为101.2%（RSD=0.84%，n=6）。结论所建的标准可用于青乳消颗粒的质量控制。

［关键词］青乳消颗粒；迷迭香酸；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法

青乳消颗粒由青皮、夏枯草、浙贝母、乳香、昆布共5味药材组成，对肝郁气滞、肝郁气滞兼痰凝血淤型乳廦具有很好的疗效。为控制该制剂的质量，保证临床用药的安全，本研究对其进行了质量标准研究，为青乳消颗粒的质量控制提供科学依据。

1.1　仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（在线脱气机、二元泵、自动进样器、VWD检测器），电子天平（梅特勒-托利多测量技术有限公司，批号：XP-205），超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，批号：KQ-250B）。

1.2　试药

青皮对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：110727-200306）、夏枯草对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：110740-201006）、浙贝母对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：110750-201110）、乳香对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：110970-200904）、迷迭香酸（中国食品药品检定研究院，批号：111871-201102）；甲醇（Merck KgaA，色谱纯，批号：I610507142），水为超纯水（临用新制），其他试剂均为分析纯；青乳消颗粒，规格：10 g/袋（扬子江药业集团有限公司，批号：13031501、13031502、13031503）。

2.1　定性鉴别

2.1.1　青皮的薄层鉴别　取本品30 g，研细，加甲醇100 ml，回流提取30 min，滤过，取滤液5 ml（其余滤液备用），加于活性碳-氧化铝柱（活性炭0.5 g与中性氧化铝100～120目1 g，混匀，内径1.5 cm），用甲醇10ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，取上清液作为供试品溶液。取对照药材1 g、阴性样品20 g按同法制成对照药材溶液和阴性样品溶液。吸取上述3种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮-甲醇-浓氨试液（8∶3∶3∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5%的茚三酮乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点（图1）。

 

图1　青皮的薄层鉴别图谱

2.1.2　夏枯草的薄层鉴别 取本品4 g，加乙醇100ml，超声提取30min，放冷，滤过，滤液蒸干。加水20ml，加热使之溶解，用稀盐酸调节pH值至2～3，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加乙醇1 ml使溶解，作为供试品溶液，取阴性样品3 g按同法制成阴性样品溶液，另取夏枯草对照药材0.5 g，加水25ml，煎煮1 h，放冷，滤过。取滤液，自“用稀盐酸调节pH值”起，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述3种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水（7∶2∶0.5∶0.3）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点（图2）。

 

图2　夏枯草药材薄层鉴别图

2.1.3　浙贝母的薄层鉴别 取2.1.1项下青皮的薄层色谱鉴别项下的剩余滤液，蒸干，残渣加0.05 mol/L盐酸溶液20 m l，超声处理5 min，滤过，滤液用氢氧化钠试液调节pH值至12～14，用二氯甲烷振摇提取2次，每次20ml，合并提取液，回收二氯甲烷至约1 ml，作为供试品溶液，对照药材溶液和阴性样品溶液按同法制备。吸取上述3种溶液各10μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以醋酸乙酯-甲醇-浓氨试液（17∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点（图3）。

 

图3　浙贝母药材薄层鉴别图

2.1.4　乳香的薄层鉴别　取本品10 g，按照挥发油测定法，加环己烷0.5 m l，缓缓加热至沸，并保持微沸1 h，放置0.5 h后，分取环已烷溶液，作为供试品溶液。另取阴性样品6 g，乳香对照药材2 g，同法制成阴性样品溶液和对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茴香醛试液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点（图4）。

 

图4　乳香药材薄层鉴别图谱

2.2　含量测定

2.2.1　色谱条件　色谱柱：Eclispse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：甲醇-0.2%甲酸（45∶55）；波长：330 nm；流速：1.0ml/min。

2.2.2　对照品溶液的制备 取干燥至恒重的迷迭香酸对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1 ml含约有20μg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.3　供试品溶液的制备 取本品10 g，研细，取约2.0 g精密称取，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 ml，密塞，超声处理（功率250W，频率40 kHz）10min，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4　阴性样品溶液的制备 原方去夏枯草后，按处方比例，照本品制备工艺制备阴性样品。取缺夏枯草的阴性样品约2.0 g，精密称定，按样品溶液制备方法制成溶液，作为阴性样品溶液。

2.2.5　系统适用性 按2.2.1项下色谱条件测定，迷迭香酸的保留时间为11.2min。以迷迭香酸计，理论塔板数为6457，分离度为4.4，表明该色谱条件下系统适用性良好。

2.2.6　精密度试验 取2.2.2项下对照品溶液，精密吸取10μl，连续进样6次，结果迷迭香酸峰面积RSD 为0.2%，表明仪器精密度良好。

2.2.7　专属性考察 取阴性样品溶液，精密吸取续滤液10μl，注入高效液相色谱仪，按2.2.1项下的色谱条件测定，记录色谱图。由色谱图可知，阴性样品在与迷迭香酸对照品相应位置上无吸收峰出现，表明该方法专属性良好（图4）。

2.2.8　线性关系考察 精密称取迷迭香酸对照品10.11mg，置于100 ml量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述对照品溶液，精密吸取上述对照品溶液2.5、2.5、5、5、10、20ml，分别置于200、100、100、50、50、50ml量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，按2.2.1项色谱条件进行测定。以对照品浓度（μg/m l）为横坐标，对照品峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，得回归方程y=35.85x-1.89（r=0.99995）。结果表明，迷迭香酸在1.26～40.36μg/ml范围内线性关系良好。

2.2.9　重复性试验 按照2.2.3项下方法配制6份供试品溶液（批号：13031501），采用2.2.1项下色谱条件进行测定，结果迷迭香酸峰面积RSD为0.92%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.2.10　稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于配置后0、2、4、8、12 h按2.2.1项下色谱条件进行测定，结果迷迭香酸峰面积RSD为0.66%（n=6），表明该方法稳定性良好。

2.2.11　中间精密度试验 另1位实验人员第2天使用另1台仪器，精密称取同一批号样品6份，按照2.2.3项下的制备方法供试品溶液，进行测定。结果迷迭香酸峰面积RSD为1.0%（n=12），表明该方法中间精密度良好。

 

图5　迷迭香酸对照品、青乳消颗粒样品、阴性样品的HPLC图

2.2.12　准确度试验 精密吸取25 ml迷迭香酸对照品（浓度为101.1μg/ml），置于500m l量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，备用。采用加样回收法，取已知含量的同一批号样品（批号：13031501），精密称定6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入上述对照品溶液（5.06μg/m l）50 ml，按照2.2.3项下供试品溶液的制备方法制备，进行测定，计算回收率。迷迭香酸的平均回收率为101.2%，RSD=0.84%（表1），表明本法回收率良好。2.2.13　含量测定 取3批样品（批号：13031501、13031502、13031503），按2.2.3项下制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，按2.2.1项下色谱条件测定迷迭香酸含量，结果3批样品的含量分别为2.9、3.0、2.9mg/袋，平均为2.9mg/袋（表2）。

表1　迷迭香酸准确度试验（n=6）

表2　3批样品的含量

清乳消颗粒由青皮、夏枯草、浙贝母、乳香、昆布共5味药材组成，笔者对方中所有药味都进行了研究。根据《中国药典》2010版中有关薄层色谱鉴别的要求［1］，经过预实验及查阅相关文献［2-4］，分别对不同的薄层板、不同的展开剂、点样量等展开条件进行了考察，最终确定了青皮、夏枯草、浙贝母、乳香的薄层鉴别条件。

迷迭香酸是一种天然多功能酚酸类化合物。迷迭香酸具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏、抗氧化、抗血栓抗血小板聚集、防辐射和免疫抑制等作用［5］，是治疗乳廦的有效成分，因此选此做为清乳消颗粒的含量测定指标。

根据迷迭香酸的理化性质［5］，分别用水、稀乙醇、乙醇作为提取溶剂提取样品，结果以稀乙醇提取效果最好，故选用此作为提取溶媒。比较了超声提取法和回流提取法［6-7］，两者提取效率相差不大，出于节能及操作简便性等因素考虑，选择超声提取法作为本制剂的提取方法。考察了超声提取10、20、30、40 min对迷迭香酸提取率的影响，结果表明10min已可以提取完全，故选择10min作为本制剂的提取时间。比较了乙腈-水（35∶65）、乙腈-0.1%醋酸（32∶68）、甲醇-0.2%甲酸（45∶55）［8-10］3种流动相，结果以甲醇-0.2%甲酸（45∶55）分离效果最好，所以以此作为流动相。本实验采用HPLC建立了青乳消颗粒中的迷迭香酸的含量测定方法，该方法简便、快速、准确、可靠，可作为青乳消颗粒的质量控制方法。

［1］国家药典委员会.中国药典2010版一部［M］.北京：化学工业出版社，2010.

［2］刘智勇，李颖，胡晓斌，等.胆宁胶囊的薄层色谱鉴别［J］.华西药学杂志，2003，18（6）：480-481.

［3］伍丕娥，周娟，徐延泽，等.喉泰喷雾剂的薄层鉴别［J］.华西药学杂志，2003，18（4）：294-295.

［4］王苏会，闫荟，王瑞，等.消骨增贴中乳香、没药的薄层鉴别［J］.中国医院药学杂志，2009，29（5）：414.

［5］黄幼霞，黄荣桂，郑兴中.迷迭香酸药理作用的研究进展［J］.海峡药学，2010，22（5）：17-20.

［6］张坤，许秋雁，叶小燕，等.RP-HPLC法测定迷迭香中鼠尾草酸和迷迭香酸的含量［J］.中南药学，2013，11（8）：603-605.

［7］邹盛勤，孙小青.超声辅助萃取RP-HPLC法测定不同产地迷迭香中迷迭香酸含量［J］.中国食品添加剂，2010，11 （3）：223-227.

［8］吴良，袁干军，苏秋玲.高效液相色谱法测定迷迭香中迷迭香酸的含量［J］.海南医学院学报，2006，12（2）：112-114.

［9］何默忠，葛秀丹，陈正收，等.反相高效液相色谱法测定迷迭香中鼠尾草酚、鼠尾草酸和熊果酸含量［J］.上海医药，2009，30（10）：469-470.

［10］陈丽，敬应春，周银，等.HPLC法测定五淋化石颗粒中迷迭香酸［J］.国际药学研究杂志，2013，40（1）：105-107.

Study on quality standards of Qingruxiao particles

ZENG Hai-song　YU Jie-dong▲　SHAO Qui-hong
The Institute of Traditional Chinese Medicine of Yangtze River PharmaceuticaiGroup，Taizhou　225321，China

［Abstract］Objective To establish the quality standard of Qingruxiao particles.Methods Green Tangerine Peel，Prunella vulgaris Linn，Fritillaria thunbergii，Boswellia carteri were identified by TLC，and rosmarinic was determined by HPLC. Results TLC spots developed were fairly clear，and the blank test showed no interference.The linear range of rosmarinic was between 1.26 and 40.36μg/ml（r=0.99995，n=6），and the average recoveries was 101.2%，RSD was 0.84%（n=6）.The method was simple，high sensitivity，good reproducibility and reliable.Conclusion The detection method can be used as the determination of the rosmarinicin Qingruxiao particles.

［Key words］Qingruxiao particles；Rosmarinic；Quality standard；Thin-layer chromatography；High-performance liquid chromatography

［中图分类号］R286.0

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）09（c）-0122-04

（收稿日期：2016-06-30本文编辑：王红双）

［作者简介］曾海松（1980-），男，河南信阳人，硕士，研究所副所长，主管中药师，主要从事中药新药研发工作

▲通讯作者：俞洁东（1985-），男，浙江金华人，硕士，主管中药师，主要从事中药新药研发工作