王婧怡1　　高　洁2

1.洛阳市食品药品检验所中药室，河南洛阳　471000；2.郑州铁路职业技术学院药学系，河南郑州　450000

［摘要］目的优化益母草生物碱的最佳提取工艺，为其进一步开发提供理论基础。方法采用L9（34）正交实验法，以生物碱总量为判断标准，考察冷浸提取法中酸浓度、乙醇浓度、浸提时间、浸提次数对生物碱总量的影响。结果益母草总生物碱的最佳提取工艺为70%乙醇提取2次，每次40min，0.10mol/L的盐酸溶解。结论本研究所建立的最佳提取工艺简便、经济、可行。

［关键词］正交试验；益母草；生物碱；提取工艺

益母草原名茺蔚，为唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的地上部分，始载于《神农本草经》，具有活血祛瘀、舒肝调经、利尿退肿的功效［1］。益母草具有抗心肌缺血、抗炎镇痛等药理作用［2-8］。研究表明发挥以上药理作用的物质基础是益母草总生物碱，主要包括益母草碱和水苏碱等［9-12］。

本文采用正交实验法对益母草总生物碱进行回流提取，研究了酸浓度、乙醇浓度、浸提时间、浸提次数等因素对提取结果的影响，以期确定最佳的提取工艺，为益母草总生物碱的批量生产提供理论基础。

1.1　仪器

FY130中草药粉碎机（上海书培实验设备有限公司）；FA2104A电子分析天平（上海精天电子仪器有限公司）；RE52AA型旋转蒸发仪（北京成萌伟业科技有限公司）；A390紫外可见分光光度计 （上海翱艺仪器有限公司）；HH-SZ1-6电热恒温水浴锅（北京长安科学仪器厂）。

1.2　试药

益母草购自河南本草国药馆连锁有限公司，经鉴定为唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的地上部分；盐酸水苏碱对照品 （中国药品生物检定所）；雷氏盐（中国药品生物检定所）；无水乙醇、雷氏盐、丙酮、盐酸均为分析纯。

2.1　预处理

益母草经处理去除表层泥沙，自然晾干，烘箱中60℃烘6 h至恒重。粉碎后过40目筛，得益母草粉末备用。

2.2　对照品的制备

精密称取干燥恒重的盐酸水苏碱对照品50 mg，加0.10 mol/L盐酸溶解，稀释转移制50 ml容量瓶中，摇匀定容至刻度（终浓度为1mg/ml）。从中分别精密吸取0、1、3、5、7、9ml置于25ml容量瓶中，再分别向内精密加入新制的2%硫氰酸铬铵溶液3 ml，摇匀，加0.1mol/L盐酸溶液定容至刻度，过滤。取滤液在520 nm波长处测定吸光度，以盐酸溶液作空白对照，以吸光度值A为纵坐标，标准品浓度C为横坐标绘制标准曲线［13］，线性回归方程为：A=0.9425C+0.02，r=0.9901。

2.3　样品溶液的制备

称取干燥至恒重的益母草粉末5.00 g左右，加入100m l乙醇溶液浸泡，按照设计好的条件进行浸提，提取后取出过滤，蒸干滤液得提取物粉末，用20 ml既定浓度的盐酸溶液溶解并过滤。用同浓度的盐酸洗涤，定容至100ml，得样品溶液。

2.4　提取条件设计

考察酸浓度、乙醇浓度、浸提时间、浸提次数等因素对浸提效果的影响，寻求各因素最佳提取工艺条件，根据单因素试验结果各取3个水平进行L9（34）正交试验。

2.5　单因素试验

2.5.1　酸浓度的考察　取益母草粉末5.00 g左右，共5份，加入95%乙醇溶液100 ml浸提30 min，浸提3次，合并滤液并过滤，蒸干滤液得提取物粉末，分别加0.00、0.05、0.10、0.15、0.20 mol/L的盐酸溶液溶解过滤定容至100ml，即得。按“2.2”项下步骤测定，在520 nm处测定浸提液吸光度，计算总生物碱的含量作为提取指标。结果在上述酸浓度下益母草生物碱的提取率分别为0.34%、0.42%、0.58%、0.53%、0.48%。结果表明，益母草总生物碱提取率随着酸浓度的升高而逐渐增加，酸浓度在0.10mol/L益母草总生物碱提取率最高，酸浓度＞0.10mol/L益母草总生物碱提取率随酸浓度升高而降低。因此，提取中酸浓度不宜过高或过低，本次正交实验选择酸浓度为0.05、0.10、0.15 mol/L三个水平。

2.5.2　乙醇浓度的考察 取益母草粉末5.00 g左右，共5份，分别加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液100m l浸提30min，浸提3次，合并滤液并过滤，蒸干滤液得提取物粉末，加0.10mol/L盐酸溶液溶解过滤定容至100 ml，即得。按“2.2”项下步骤测定，在520 nm处测定浸提液吸光度，计算总生物碱的含量作为提取指标。结果在上述乙醇浓度下益母草生物碱的提取率分别为0.43%、0.51%、0.67%、0.59%、0.52%。结果表明，乙醇体积分数为60%～80%时，益母草生物碱提取率较高，体积分数为70%时益母草总生物碱提取率最高，＞70%时益母草生物碱提取率随体积分数的升高而降低。因此，提取中乙醇的体积分数不宜过高或过低，本次正交实验选择酸浓度为60%、70%、80%三个水平。

2.5.3　浸提时间的考察 取益母草粉末5.00 g左右，共5份，加入70%乙醇溶液100 m l分别浸提10、20、30、40、50 min，浸提3次，合并滤液并过滤，蒸干滤液得提取物粉末，加0.10 mol/L的盐酸溶液溶解过滤定容至100ml，即得。按“2.2”项下步骤测定，在520 nm处测定浸提液吸光度，计算总生物碱的含量作为提取指标。结果在上述浸提时间下益母草生物碱的提取率分别为0.49%、0.57%、0.64%、0.65%、0.66%。结果表明，益母草总生物碱提取率随着提取时间的延长而逐渐增加，提取时间为30 min时益母草总生物碱提取率最高，提取时间＞30min时益母草总生物碱提取率随时间延长而趋于稳定。因此，结合实际生产的效益，本次正交实验选择浸提时间为20、30、40 min三个水平。

2.5.4　浸提次数的考察 取益母草粉末5.00 g左右，共5份，加入70%乙醇溶液100 ml浸提30 min，分别浸提1、2、3、4、5次，合并滤液并过滤，蒸干滤液得提取物粉末，加入0.10 mol/L液溶解过滤定容至100 ml，即得。按“2.2”项下步骤测定，在520 nm处测定浸提液吸光度，计算总生物碱的含量作为提取指标。结果在上述浸提次数下益母草生物碱的提取率分别为0.42%、0.55%、0.62%、0.67%、0.68%。结果表明，益母草总生物碱提取率随着浸提次数的增加而逐渐增加，浸提次数为3次时益母草总生物碱提取率最高，提取次数＞3次时益母草总生物碱提取率随次数的增加而趋于稳定。因此，结合实际生产的效益，本次正交实验选择浸提次数为2、3、4次三个水平。

2.6　正交试验

结合单因素试验的考察结果，选取影响益母草总生物碱提取效率的酸浓度、乙醇浓度、浸提时间、浸提次数因素中有意义的三个水平进行试验，分析结果以确定最佳的提取工艺。因素水平见表1。L9（34）正交实验设计、实验结果及方差分析见表2、表3。由结果可知影响因素的大小顺序酸浓度＞乙醇浓度＞浸提次数＞浸提时间，最佳水平为A2B2C3D1，因此益母草总生物碱的最佳提取工艺为70%乙醇提取2次，每次40min，0.10mol/L的盐酸溶解。

表1　因素水平表

表2　正交试验设计及结果

表3　方差分析

2.7　验证试验

为了确定正交试验确定的条件是否为最佳工艺，称取3份益母草药材粉末，如表4所示，按照“3.2”确定的A2B2C3D1条件进行了3次重复性试验，结果益母草生物碱的含量为分别为0.684%，0.681%，0.702%，平均值为0.689%，RSD为1.648%，表明该提取条件稳定可行，具有重现性和稳定性，提取工艺为70%乙醇提取2次，每次40 min，0.10mol/L的盐酸溶解为益母草生物碱的最佳提取工艺。

表4　正交工艺验证

目前，关于益母草生物碱的研究［14-16］逐年增多，益母草文献中报道，益母草总生物碱的提取方法有微波提取法、表面活性剂超声提取法、煎煮法、浸渍法等［17-19］。有研究采用大孔吸附树脂水洗脱液分离纯化得到的总生物碱操作简便、经济［20］。本实验采用单因素和正交实验设计，优化冷浸法提取益母草总生物碱的工艺，结果表明最佳提取工艺为A2B2C3D1，即70%乙醇提取2次，每次40 min，0.10 mol/L的盐酸溶解，得率为0.69%。其中酸浓度对实验结果的影响最大，其次分别是乙醇浓度、浸提次数、浸提时间。本研究所建立的最佳提取工艺简便、经济、可行，值得推广应用。

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Study on extraction technology of Motherwort alkaloids by orthogonal test

WANG Jing-yi1GAO Jie2
1.Mesothecium，Luoyang City Institute for Food and Drug Control in Henan Province，Luoyang 471000，China；2.Department of Pharmacy，Zhengzhou Railway Vocational and Technical College，Zhengzhou　450000，China

[Abastract]Objective To select the optimum extraction technology of Motherwort alkaloids.Methods L9（34）orthogonal test was used.The total alkaloids was dectected as the criterion to investigate the effect of acid concentration，ethanol concentration，extraction time and extraction times on total alkaloids in cold-dipping extraction.Results The optimum extraction technologywas 70%ethanol concentration，extracted two times，40minutes each time，dissolved with 0.10mol/L Hydrochloric acid.Conclusion The optimum method is Simple，economical and feasible.

[Key words]Orthogonal test；Motherwort；Alkaloids；Extraction technology

［中图分类号］R944.9

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）09（c）-0004-03

（收稿日期：2016-06-10本文编辑：方菊花）