王　珍　赵昌林▲　骆敏翔

广州中医药大学祈福医院，广东广州　511495

［摘要］目的 构建含人HSP72的慢病毒，筛选获得稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞系。方法 采用PCR方法从MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA中调取HSP72基因的完整序列，利用双酶切及体外重组的方法获得pLV-HSP72-EGFP（2A）质粒，经PCR、测序方式鉴定成功后，对病毒进行包装。用病毒感染hUC-MSC，并用Puro进行抗性筛选可稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞系。结果构建的pLV-HSP72-EGFP（2A）测序结果与GenBank收录序列一致，包装得到pLV-HSP72-EGFP（2A）病毒，筛选获得稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞系，ELISA方法检测显示获得的细胞株可过表达HSP72。结论 构建了获得稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞系。

［关键词］HSP72；人脐带间充质干细胞；慢病毒载体；转染

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是老年痴呆中最常见的一种类型，其患病率随年龄增高而升高，在65岁以上人群中约为5%，85岁以上人群中约为20%［1］。有研究结果发现，分子伴侣的主要成分HSP72可以通过减少Aβ的聚集，促进Aβ的清除，减少tau蛋白的过度磷酸化，减少神经元的丢失，促进神经突触的可塑性等途径参与AD发病进展的多个环节，是防治AD的非常有价值的靶点之一［2］。基因治疗是近年来研究热度非常高的一种治疗策略，借助基因治疗，寻找一种稳定、长效脑内表达HSP72的给药方法和策略值得进一步探讨。本研究通过第三代慢病毒载体系统，将HSP72插入慢病毒载体，并选择具有神经细胞分化潜能、来源丰富、无伦理学争议的人脐带间充质干细胞 （human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSC）作为工具细胞，建立一种HSP72过度表达与hUC-MSC移植结合起来的治疗方法和策略，为进一步动物实验疗效评估和应用安全性评估奠定基础。

1.1　材料

hUC-MSC是本实验室从健康新生儿脐带卡通式胶中分离纯化培养所得，DMEM培养基 （Hyclone公司，SH30021），胎牛血清（Gibco公司，8180833）；CD105-PE、CD73-PE、CD90-PE（BD公司，65414），mouse IgG1-PE（BD公司，78454），CD45-FITC、CD34-FITC和HLA2DRFITC（BD公司，89470）、mouse IgG1-FITC（BD公司，87592）和mouse IgG2a-FITC（BD公司，86738）；MSC成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞分化试剂盒（Cyagen公司分装）；MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA（Open biosystem，Thermofisher公司，2933），pLVEF1a-EGFP（2A）Puro慢病毒载体（北京英茂盛业科技有限公司，VL3404），EcoRI限制性内切酶（Takara公司，D1040A），BamHI限制性内切酶 （Takara公司，D1010A），T4DNA连接酶（Thermo公司，EL0011），DNA回收试剂盒（美基生物科技有限公司），KOD Plus DNA聚合酶（TOYOBO公司，201）、XL1-Blue MRF′感受态细胞（辉骏生物科技有限公司冻存），慢病毒转染试剂（辉骏生物科技有限公司分装）；HSP72 ELISA检测试剂盒（武汉新启迪生物科技有限公司，EIA05352）。

1.2　方法

1.2.1　hUC-MSC的培养及鉴定　经产妇知情同意后，留取健康新生儿近脐端5～10 cm，小心剔除两条脐动脉，一条脐静脉，保留卡通式胶，剪碎至1 mm3，接种于培养瓶。待细胞自组织块爬出并融合至60%时，去除组织块继续培养，常规1∶2传代。取第三代hUCMSC用荧光抗体标记和流式细胞仪检测的方法进行表面标志物的鉴定，并按说明书要求的步骤进行向骨、脂肪、软骨方向分化能力的诱导和鉴定。

1.2.2　目的基因调取　以MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA为模板，设计两条引物，分别为序列5′-3′ATGAATTCATGGCCAAAGCCGCGGCGATC（含EcoRI酶切位点）和序列5′-3′AT GGATCC CTAATCCACCTCCTCAATGGTGGGG（含BamHI酶切位点），引物序列送广州辉骏生物科技有限公司合成，做PCR调取目标片段HSP72并纯化回收。

1.2.3　慢病毒载体的构建及包装　用EcoRI和BamHI酶切HSP72纯化产物和慢病毒表达载体，基因片段与载体做连接反应，获得pLV-HSP72-EGFP（2A），转化感受态细胞包装，挑取检测阳性的菌落摇菌，抽提质粒阳性克隆送测序验证。按慢病毒表达系统操作手册对构建的慢病毒载体进行包装，进行滴度测定，分装冻存。

1.2.4　慢病毒转染及稳表达细胞株的构建　第1天将hUC-MSC接种至6孔板中，常规培养基培养过夜，添加含pLV-HSP72-EGFP（2A）病毒的细胞培养液（计算MOI值为200），感染6 h后，弃去含病毒的培养液，更换常规培养液继续培养，第4天传代后观察转染率可达50%～60%，第5天更换含0.5μg/ml Puro的培养液继续进行抗性筛选，3 d换液一次，以未感染病毒的hUC-MSC做对照，筛选持续到第12天，此时对照组未感染病毒的hUC-MSC几乎全部死亡，可获得稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞株。

1.2.5　HSP72蛋白表达 用ELISA的方法检测该细胞株培养上清液HSP72的过表达情况，实验方法依照说明书进行。以pLV-EGFP（2A）hUC-MSC和未感染病毒的hUC-MSC做对照。

2.1　hUC-MSC的获得和鉴定

自第7天开始有hUC-MSC从组织块中爬出，细胞不断增殖并传代，细胞呈成纤维细胞样克隆性生长，培养至2周左右，细胞呈均一的纺锤形，呈旋涡状生长。流式细胞仪检测显示CD105、CD73、CD90阳性标志物表达量均＞95%，而阴性标志物CD45、CD34和HLA2DR均＜1%（图1）。图2提示hUC-MSC成骨、成软骨、成脂诱导分化后，均有阳性物质检出。

2.2　质粒的构建与鉴定

经EcoRI和BamHI双酶切，在2000 bp±、1000 bp±处可获得两条预计条带，分别与1926 bp的HSP72和9549 bp的pLV-EF1a-EGFP（2A）Puro慢病毒载体相一致（图3）。基因片段与载体做连接反应，获得pLVHSP72-EGFP（2A），转化感受态细胞包装，挑取检测阳性的菌落摇菌，抽提质粒阳性克隆送测序验证，分5段测序，拼接后与目的基因序列一致。

2.3　稳定表达HSP72的hUC-MSC细胞株的获得

感染第4天，可看到感染组绿色荧光表达，表达率为50%～60%，加入Puro进行抗性筛选后hUC-MSC对照组的细胞陆续坏死消融，pLV-HSP72-EGFP（2A）hUC-MSC和pLV-EGFP（2A）hUC-MSC组未转染成功的细胞坏死，转染成功的细胞不断增殖，荧光显微镜下显示绿色荧光表达量逐渐增多，筛选至12 d停止抗性筛选，收集细胞冻存备用（图4）。

取 pLV-HSP72-EGFP（2A）hUC-MSC、pLVEGFP（2A）hUC-MSC和hUC-MSC对照组培养液上清进行ELISA检测，结果显示pLV-HSP72-EGFP （2A）hUC-MSC细胞上清中的HSP72浓度为（14.14± 1.76）pg/ml，明显高于pLV-EGFP（2A）hUC-MSC对照组和hUC-MSC对照组 （P＜0.05），而pLV-EGFP （2A）hUC-MSC和hUC-MSC两组表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

随着人口老龄化的进程，AD发病率逐年提高，其特征性病理特征为：神经元胞外β淀粉样蛋白沉积形成的老年斑 （SP），tau蛋白过度磷酸化形成的神经元内神经纤维缠结（NFTs），神经元、突触的大量丢失［3］。Di等［4］在AD进展的调查中进行了一个细胞应激反应，结果显示，轻度认知障碍的患者海马区、颞叶脑区内的伴有多种HSPs（HSP27，HSP32，HSP60，HSP70，HSP90）表达量的增加，并建议HSPs作为AD的早期诊断监测指标，HSPs也可能成为治疗AD的合适靶点之一。国内外学者研究显示HSP70参与AD多个环节，可减少Aβ聚集、促进Aβ清除、减少tau蛋白过度磷酸化、减少神经元丢失，拮抗AD［5］。有研究显示，替普瑞酮能诱导大鼠海马区HSP70表达，进而抑制线粒体凋亡途径及部分死亡受体凋亡途径的激活发挥抗凋亡作用，神经元损伤下调，可见HSP70不仅作为细胞内蛋白发挥作用，还可以通过旁分泌的途径从免疫调节等其他方面发挥拮抗AD的作用［6］。本课题组在AD的防治方面进行了大量的前期工作，提出通过基因转导的方式构建过表达HSP70的干细胞，移植后可长期稳定地表达HSP70，可能是治疗AD的有效途径。前期研究构建腺病毒质粒转染HSP70至大鼠神经干细胞，离体和在体动物实验均显示可提高学习记忆功能，拮抗AD进展［7］。但腺病毒存在免疫原性高，易被机体清除的致命弱点，故本研究将从寻找更佳的工具细胞（无创获取、多代次传代、可在体内长期存活、具备神经再生功能、易推广）和更佳的转染方式（长期稳定的表达目的蛋白）入手，进一步探讨。

基因治疗已经作为一种手段进行临床疑难疾病的治疗，初显成效。其中工具细胞的选择至关重要，间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）作为间叶组织的干细胞，既可以自我更新和繁殖，也可以分化成为多种组织成分，且其免疫原性低，在异体移植时不易发生免疫排斥反应，这些特性使MSC成为组织工程研究的热门工具细胞。文献报道从骨髓、脐带血、脂肪、胎盘、脐带等多种组织均能分离得到MSC，目前，用于构建组织工程的工具细胞常选择骨髓MSC，但随着年龄的增长，骨髓MSC细胞数量和增殖能力均显著下降。本研究选择hUC-MSC作为工具细胞有三方面优势：①脐带来自产妇生产过程中的废弃物，获取方便，不存在伦理学争议。②hUC-MSC免疫原性低，甚至有报道显示MSC有类似免疫抑制剂的作用，目前已有大量关于MSC与造血干细胞联合应用，减少移植物抗宿主病的文献报道［8］，hUC-MSC已被批准异体应用于预防GVHD。故异体移植后能长期存活在患者体内，表达目的基因，持续发挥治疗效果。③hUC-MSC在体内外因素的诱导下，可分化为神经样细胞［9-10］，主要包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，且已有hUC-MSC治疗脑伤损性疾病的临床试验研究报道，结果显示有一定临床应用价值［11］。分化后的神经样细胞除了继续表达转染的基因发挥治疗效果外，分化后的细胞本身对AD也起到神经修复作用。本研究选择hUC-MSC作为工具细胞，并根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会标准［12］，对获得的hUC-MSC从形态学、表面标志物、多向分化潜能方面进行鉴定。

基因治疗的另一关键问题在于如何将目的基因准确无误地导入靶细胞，并使其在宿主细胞中高效稳定地表达，因此，理想的载体应具备以下条件：①转染能力强，能够转染处于分裂期和非分裂期的各种细胞；②细胞毒性低或无细胞毒性；③能够保证目的基因高效转染和长期表达；④载体容量大，可用于构建多基因的共表达系统；⑤易合成，稳定性好，便于浓缩和纯化；⑥缺乏自我复制能力，可控性高。目前，常用的基因转移载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等，这些转移介质中，质粒转导效率很低，使用价值不大。逆转录病毒载体则难以达到高滴度，只能转染处于分裂期的靶细胞，而且它可以整合至靶细胞染色体的任意位置，有插入突变的潜在危险，不适合临床应用。腺病毒虽然能够转染分裂期和非分裂期的细胞，但因其只能实现瞬时表达，不能发挥远期疗效，且反复应用易引起严重的免疫反应，从而导致疗效下降。近年来发展起来的慢病毒载体克服了上述转染载体的诸多劣势，其转染能力强，载体容量大，此外还具备免疫反应小，无复制能力等诸多优点，被广泛应用［13-14］。苏玉金等［15］的研究显示，腺病毒载体介导的基因转染率骨髓MSC的转染率仅为49.1%，远远低于慢病毒载体的91.4%（P＜0.01），提示以慢病毒为载体的转染方式更适合干细胞的基因导入。

本研究从GeneBank中获取了人类HSP70家族的主要成分HSP72的基因 ［基因名称HSPA1A，piens heatshock 70kDa protein 1A，mRNA（cDNA cloneMGC：15236 IMAGE：4123837）］，选择新一代的非融合性、双启动子pLV-EF1a-EGFP（2A）Puro慢病毒载体，通过酶切和重组的方式获得了pLV-HSP72-EGFP （2A），经PCR、多酶切鉴定及测序的方式比对正确后，采用感受态细胞对该病毒进行包装。pLV-HSP72-EGFP（2A）病毒感染hUC-MSC，用puro抗性基因筛选三代后，获得稳表达HSP72的pLV-HSP72-EGFP （2A）hUC-MSC细胞系。ELISA检测结果显示，pLVHSP72-EGFP（2A）hUC-MSC培养液上清中的HSP72表达量明显高于pLV-EGFP（2A）hUC-MSC细胞和hUC-MSC对照组，而pLV-EGFP（2A）hUC-MSC细胞和hUC-MSC对照组培养上清液中的HSP72表达量无明显差别。pLV-HSP72 hUC-MSC细胞系的建立，为进一步HSP72治疗AD的实验研究提供工具和基础。

［1］李润辉.阿尔兹海默病的研究现状［J］.沈阳医学院学报，2013，15（3）：129-133.

［2］Repalli J，Meruelo D.Screening strategies to identify HSP70 modulators to treat Alzheimer′s disease［J］.Drug Des Devel Ther，2015，（9）：321-331.

［3］张赓，吴金娟，姜淼，等.中医药治疗阿尔兹海默病的研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（6）：217-222.

［4］Di Domenico F，Sultana R，Tiu GF，et al.Protein levels of heat shock proteins 27，32，60，70，90 and thioredoxin-1 in amnestic mild cognitive impairment∶an investigation on the roleofcellularstress response in the progression of Alzheimer disease［J］.Brain Res，2010，（1333）：72-81.

［5］邱玉华，窦非.分子伴侣作为阿尔兹海默病治疗靶标的研究进展［J］.东南大学学报（医学版），2011，30（3）：522-525．

［6］鲍娟，杨期东，周琳，等.替普瑞酮诱导阿尔茨海默病大鼠海马热休克蛋白70表达及抗凋亡机制［J］.中国神经精神疾病杂志，2010，36（11）：662-666．

［7］舒晓明，逯丹，王珍，等.pEGFP-HSP70重组质粒的构建及其在大鼠神经干细胞中的表达［J］.中国病理生理杂志，2014，30（5）：842-846.

［8］张晓婷，段连宁，丁丽，等.非血缘供者异基因外周血造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗恶性血液病临床研究［J］.中国实验血液学杂志，2015，23（5）：1445-1450.

［9］刘莎，吴明，施兵奇，等.脐带间充质干细胞通过上调神经营养因子表达改善Aβ损伤大鼠的学习记忆能力［J］.中国药理学通报，2016，32（7）：980-985.

［10］朱天琦.间充质干细胞体外分化为神经样细胞的研究进展［J］.中华小儿外科杂志，2014，35（1）：72-75.

［11］冯龚，田国萍，李莉，等.人脐带血间充质干细胞治疗脑梗死的临床疗效研究［J］.实用心脑肺血管病杂志，2014，22（1）：28-30.

［12］Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The internationalsociety forcellular therapy position statement［J］. Cytotherapy，2006，8（4）：315-317.

［13］付霞霏，何援利，纪露露，等.大鼠miR-21慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达［J］.广东医学，2015，36（23）：3598-3600.

［14］王露，翟玮玮，杨向荣，等.慢病毒介导RNA干扰沉默Fas基因在脐带间充质干细胞中的表达［J］.南方医科大学学报，2014，24（10）：1475-1480.

［15］苏玉金，赵育梅，顾漪.腺相关病毒及慢病毒载体对骨髓间充质干细胞基因转染效率的比较［J］.中国康复理论与实践，2014，12（20）：1117-1121.

Construction of human umbilical cord mesenchymal stem cell lines to secret stable human HSP72 with Lenti-viral Vector

WANG Zhen　ZHAO Chang-lin▲　LUOMin-xiang
Clifforo Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou　511495，China

［Abstract］Objective To construct Lenti-viral Vector carrying human HSP72 gene，and to screen the hUC-MSC cell line with stable expression of HSP72.Methods The human HSP72 cDNA was amplified from"MGC fully sequenced human HSPAIA cDNA"by PCR.pLV-HSP72-EGFP（2A）plasmid was obtained by double enzyme digestion and in vitro recombination，then was confirmed by PCR and DNA sequencing.The pLV-HSP72-EGFP　（2A）virus was packaged. hUC-MSC was infected by the virus，and the hUC-MSC cell lines stably expressing HSP72 were screened by Puro. Results The recombinant pLV-HSP72-EGFP　（2A）was constructed.The sequence was consistentwith that reported in GenBank.The pLV-HSP72-EGFP（2A）viruswas packaged and infected hUC-MSC.By ELISA，itwas confirmed that the HSP72 protein could be expressed and secreted into the supernatant of hUC-MSC strain culture.Conclusion hUC-MSC cell linewith stable expression of HSP72 is constructed.

［Key words］Heat shock protein 72；Human umbilical cordmesenchymal stem cell；Lenti-viral Vector；Transduction

［中图分类号］R329.2

［文献标识码］A

［文章编号］1674-4721（2016）09（b）-0004-05

（收稿日期：2016-06-20本文编辑：王红双）

［基金项目］广东省广州市番禺区科技计划项目（2013-Z03-24）

［作者简介］王珍（1983-），女，博士，中级技师，主要研究方向：脑疾病的病理及病理生理学研究

▲通讯作者：赵昌林（1972-），男，博士，副主任医师，肿瘤科主任，主要研究方向：恶性肿瘤的临床及基础研究