大孔树脂分离纯化肉苁蓉总黄酮研究
徐常永1　杨　凯2
1.山东省平邑县检验检测中心，山东平邑　273300；2.北京工商大学食品学院，北京　100048
［摘要］目的 利用吸附与解吸附的原理，通过静态吸附实验，得到AB-8型大孔吸附树脂对肉苁蓉中总黄酮具有良好的吸附与解吸能力。方法通过动态吸附实验和正交试验得到较佳分离纯化工艺条件。结果上样液浓度1.5mg/ml，上样液流速3ml/min，上样液pH=6为最佳吸附条件；80%的乙醇，以3ml/min的流速洗脱，使用12倍柱床体积为最佳解吸附条件。结论 该工艺条件稳定性良好，切实可行，分离纯化前后总黄酮的质量分数由6.63%提高到72.35%，适合工业化生产。
［关键词］肉苁蓉；总黄酮；大孔树脂；分离纯化
肉苁蓉（Cistanche）为列当科多年生草本寄生植物，具有性温，味甘苦，补肾、壮阳、润肠通便的作用，素有“沙漠人参”的美誉，具有极高的药用价值［1-2］。肉苁蓉中的化学成分主要包括苯乙醇苷类、黄酮类、环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类、氨基酸类、糖类、挥发性成分及微量元素等，其中国内外学者对苯乙醇苷类化合物研究较多［3］。研究发现黄酮类化合物也有重要的生物活性，具有抗肿瘤、抗心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、免疫调节等作用［4］，而目前对肉苁蓉中黄酮类化合物的提取、分离及性能研究相对较少［5-6］。
目前从肉苁蓉中提取活性物质已有研究，但从中提取并分离纯化黄酮还未见文献报道。分离纯化黄酮的方法有很多，如溶剂萃取法［6-9］、高效液相色谱法［10］、柱层析法［11］，由于大孔树脂理化性质稳定、不溶于酸碱、不受无机盐及低分子化合物的影响，具有良好的吸附性能、使用周期长、再生简便，被广泛应用于天然产物的分离纯化［12-14］。本实验用大孔树脂分离纯化肉苁蓉中总黄酮的条件进行工艺优化，确定最佳吸附树脂类型和影响因素，寻找一种吸附性大、易于解吸的树脂及最佳纯化工艺条件。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试剂
乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙酸乙酯、石油醚（30～60℃）等（均为分析纯）试剂；芦丁对照品（生产批号100080-201408，纯度≥92.8%，购于中国食品药品检定研究院）；十二烷基硫酸钠（SDS）（化学纯）。1.1.2仪器
UV-3600紫外可见红外光谱仪：岛津国际贸易（上海）有限公司；HL-2数显恒流泵：上海沪西分析仪器厂有限公司；LT电子天平：沈阳龙腾电子仪器有限公司；FW80微型高速万能试样粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司。
1.2方法
1.2.1　供试剂的制备
取干燥肉苁蓉，粉碎，过40目筛，准确称量2.000 g，按照十二烷基硫酸钠（SDS）浓度1.50%，料液比1 g∶20 ml，提取温度80℃，提取时间1.0 h的条件下提取肉苁蓉中的总黄酮。将提取液过滤离心，然后取上层清液浓缩，将得到的浓缩液，依次经石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取后再次浓缩至膏状，然后用50%的乙醇溶液定容，备用。
1.2.2　肉苁蓉中总黄酮的测定
精确称取干燥至恒重的芦丁标准品50 mg，用无水乙醇定容，摇匀，配制浓度为1 g/L的芦丁标准溶液。分别量取一定量的芦丁标准溶液即0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，于10ml容量瓶中，依次加入质量分数为5%的NaNO2溶液0.5ml，加入后摇匀，并置于实验台静置6 min；再加入质量分数为10%的Al（NO3）3溶液0.5 ml，加入后再一次摇匀，并置于实验台静置6min；再加入质量分数为4%的NaOH溶液4ml，乙醇溶液定容，摇匀，置于实验台静置8～10min，然后在最佳吸收波长510 nm处，测定不同质量浓度的芦丁标准溶液的吸光值，并绘制标准曲线。得回归方程y=16.643x－0.0081，r2=0.9995，结果表明芦丁的质量浓度在50～300 mg/L的范围内与吸光度具有良好的线性关系。
1.2.3　大孔树脂的静态吸附实验
1.2.3.1　树脂吸附实验中比吸附量、吸附率的测定　称取前期处理好的大孔树脂2.0 g，先加入5ml黄酮提取液，再加入15ml蒸馏水，摇床振荡24 h后，吸取1ml上层清液，测定其中黄酮含量，按照以下公式计算：式中，C1为静态吸附前黄酮提取液浓度（mg/ml）；C2为吸附饱和后的黄酮溶液浓度（mg/ml）；V1为加入黄酮液体积（ml）；m为干燥树脂质量（g）。
1.2.3.2　树脂解吸实验中解吸率的测定　取“1.2.3.1”实验中已吸附饱和的8种树脂，置于锥形瓶中，加入相同体积的无水乙醇，摇床振荡24 h后，吸取1 ml上层清液测定总黄酮含量，按照下式计算解吸率：。式中，C1为静态吸附前黄酮提取液浓度 （mg/ml）；C2为吸附饱和后的黄酮溶液浓度 （mg/ml）；C3为洗脱液浓度（mg/m l）；V1为供试液体积（ml）；V3为洗脱液体积（ml）。
1.2.3.3　大孔树脂静态吸附动力学特征　准确称取已处理好的大孔树脂2.0 g分别置于3个100 ml具塞三角瓶中，精确加入已知浓度的黄酮提取液50m l，室温下置于100 r/min的振荡器上振荡，同时在振荡时，每隔一段时间（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、10、16、24 h）取上清液1ml测定黄酮的浓度，按照“1.2.3.1”中的方法计算树脂的吸附量，绘制大孔树脂的静态吸附动力学曲线。
1.2.4　大孔树脂的动态吸附实验
分别考察对影响吸附效果的上样液浓度、流速、pH值进行单因素试验，确定最佳的单因素值。在单因素考察的基础上，进行多因素正交试验，通过综合分析确定最佳吸附条件。利用最佳吸附条件，分别考察对影响解吸效果的洗脱液浓度、流速、洗脱液体积进行单因素试验。在单因素考察的基础上，进行多因素正交试验，通过综合分析确定最佳解吸条件。
1.2.5　树脂的饱和比吸附量计算
2　结果
2.1　大孔树脂的静态吸附实验
2.1.1　大孔树脂的选择
弱极性的大孔吸附树脂AB-8、HPD722对肉苁蓉中总黄酮的吸附率最高，非极性的大孔吸附树脂D101、HPD300、HPD100对肉苁蓉中总黄酮的吸附率次之，而中极性和极性的大孔吸附树脂最低，因此可判定肉苁蓉中的黄酮显弱极性，从而选取弱极性的大孔吸附树脂AB-8、HPD722做进一步考察。从解吸率方面看，大孔吸附树脂AB-8的解吸率要大于HPD722型大孔吸附树脂，因此综合吸附率和解析率，应选择AB-8型大孔吸附树脂做进一步研究（表1）。
表1　八种大孔树脂对样品中黄酮的静态吸附和解吸结果

2.1.2　 AB-8型大孔吸附树脂的静态动力学特征曲线
对AB-8型大孔树脂的吸附动力学特性分析可知，AB-8型大孔树脂能够快速到达平衡，在3 h时对黄酮的吸附量基本保持不变，5 h之后基本达到树脂最大吸附量，在1 h时吸附率可以达到80%，因此AB-8树脂对肉苁蓉中总黄酮具有良好的静态吸附动力学特征（图1）。

 
图1　AB-8型大孔吸附树脂静态动力学特征曲线
2.2　大孔树脂对肉苁蓉总黄酮的动态吸附
2.2.1　上样液浓度对吸附率的影响
当上样液浓度为1.5 mg/ml时，树脂的吸附率最大，为76.1%，当浓度继续增大时，黄酮的吸附率开始降低，因此确定1.5mg/ml为上样液的合适浓度（图2）。

 
图2　上样液浓度对肉苁蓉黄酮吸附率的影响
2.2.2　上样液流速对吸附率的影响
上样液流速对总黄酮的吸附率影响并不明显，随着流速的继续增加，黄酮的泄漏量增加。上样液流速为2ml/min时，树脂的吸附率最大，因此确定2ml/min为上样液的合适流速（图3）。

 
图3　上样液流速对吸附率的影响
2.2.3　上样液pH值对吸附率的影响
随着pH值的增大，对肉苁蓉中总黄酮的吸附率也越大；当pH值达到6时，大孔树脂的吸附率达到最大；随着pH值的增大，对肉苁蓉中总黄酮的吸附率开始逐渐减小。综合考虑，选择pH为6的上样液作为最适的pH值（图4）。

 
图4　上样液pH对肉苁蓉黄酮吸附率的影响
2.2.4　多因素正交试验结果
采用正交试验设计的方法，以肉苁蓉总黄酮吸附率为考察指标进行正交试验，实验结果见表2。
表2　以肉苁蓉总黄酮吸附率为考察指标的正交试验结果

从表2可以看出，影响大孔树脂吸附率的因素顺序（r值）依次为A（上样液浓度）＞C（上样液pH）＞B（上样液流速），其中上样液浓度对大孔树脂吸附肉苁蓉黄酮的效果影响最为显著，上样液流速对大孔树脂吸附肉苁蓉黄酮的效果影响最不显著。在选取的各因素水平范围内，根据正交试验结果，得到的最佳工艺条件为A2B3C2，即上样液浓度1.5 mg/ml，上样液流速3ml/min，上样液pH为6.0时大孔树脂对肉苁蓉总黄酮的吸附率最高。
2.2.5泄露曲线的绘制
取pH为6、浓度为1.5 mg/ml的黄酮样液，流速控制在3ml/min进行动态吸附，用10ml离心管接收流出液，每一管作为一个流分，测定每个离心管中黄酮浓度。以流出液体积为横坐标，泄漏出的黄酮浓度为纵坐标，绘制泄露曲线，结果如图5所示。

 
图5　泄露曲线
如图5所示，开始吸附时，泄漏出的黄酮浓度较小，随着上样量增大，树脂的吸附能力开始变小，当上样体积达到30 ml时开始出现明显泄漏现象，继续增加上样量，泄漏出的黄酮浓度继续增大。当上样量的体积达到150ml左右时，泄漏出的黄酮浓度接近上样液浓度，说明大孔树脂已经达到饱和。本着黄酮最大吸附率的原则，选择黄酮的上样量为150m l。
2.3　大孔树脂对肉苁蓉总黄酮的动态解吸实验
2.3.1　洗脱液浓度对解吸率的影响
随着乙醇浓度的增加，解吸率也不断增加，说明乙醇浓度越大，对黄酮的解吸率就越好。当乙醇浓度达到70%后，对肉苁蓉总黄酮的解吸率与90%乙醇没有太大差别，因此选择70%、80%、90%的乙醇作进一步考察（图6）。

 
图6　不同乙醇浓度对解吸率的影响
2.3.2　洗脱液流速对解吸率的影响
洗脱液流速对总黄酮的解吸率影响并不明显，洗脱液流速为1～3ml/min的范围内，树脂的解吸率变化不大；随着流速的继续增加，解吸率呈下降趋势。所以确定1～3ml/min的范围内继续考察（图7）。

 
图7　洗脱液流速对解吸率的影响
2.3.3　洗脱液体积对解吸率的影响
随着洗脱液体积的增大，肉苁蓉总黄酮的解吸率也越大，洗脱液体积在2～6 BV的范围内时，解吸率上升幅度大；当洗脱液体积＞6 BV时，解吸率增加，但增加较慢；当洗脱液体积达到10 BV时，解析率不再增加。因此选择最佳的洗脱液体积为10 BV（图8）。

 
图8　乙醇体积对解吸率的影响
2.3.4　多因素正交试验结果
采用正交试验设计的方法，以肉苁蓉总黄酮解吸率为考察指标进行正交试验，实验结果见表3。
表3　以肉苁蓉总黄酮解吸率为考察指标的正交试验结果

从表3可以看出，影响大孔树脂解吸率的因素顺序（R值）依次为A（洗脱液浓度）＞C（洗脱液体积）＞B（洗脱液流速），其中洗脱液浓度对大孔树脂解吸肉苁蓉黄酮的效果影响最为显著，洗脱液流速对大孔树脂解吸肉苁蓉黄酮的效果影响最不显著。在选取的各因素水平范围内，根据正交试验结果，得到的最佳解吸附工艺条件为A2B1C3，即洗脱液液浓度为80%，洗脱液流速1m l/min，洗脱液体积为10 BV时对肉苁蓉总黄酮的解吸率最大。
2.3.5　洗脱曲线的绘制
将一定体积的上样液按“2.2”得到的最佳吸附条件进行吸附，用蒸馏水冲洗直到流出液为无色。按“2.3”得到的最佳洗脱条件进行洗脱，收集流出液，每管10ml，测定各个管中黄酮液浓度，绘制洗脱曲线（图9）。

 
流出液体积（m l）
2.4　最佳工艺的验证实验
按“2.2”“2.3”得到的最佳工艺条件进行吸附与解吸附实验，考察此优化工艺的稳定性，实验重复3次，测定黄酮的比吸附量、吸附率、解吸率以及分离纯化前后样品中黄酮的相对含量（表4）。
表4　最佳工艺条件的验证实验结果

由表4可知，按照“2.2”“2.3”的方法得到最佳的分离纯化工艺，即上样液浓度1.5 mg/m l，上样液流速3 ml/min，上样液pH=6；洗脱液浓度80%，洗脱液流速1 ml/min，洗脱液体积为10 BV，来制备3组平行样品，分别测定比吸附量、吸附率、解吸率。结果表明，三次平行实验结果的RSD较小，用此方法来分离纯化肉苁蓉中总黄酮相对稳定，该工艺切实可行，并且总黄酮的质量分数由6.63%提高到72.35%。
3　小结
本实验选用大孔吸附树脂对肉苁蓉中总黄酮进行分离纯化，通过静态吸附实验对树脂进行选型，实验结果表明AB-8型大孔吸附树脂具有对肉苁蓉中总黄酮良好的吸附与解吸能力。通过动态吸附、解吸实验和正交试验得到较佳分离纯化工艺条件：上样液浓度1.5 mg/ml，上样液流速3 ml/min，上样液pH=6；洗脱液浓度80%，洗脱液流速1 ml/min，洗脱液体积为10 BV。该工艺条件稳定性良好，切实可行，分离纯化前后总黄酮的质量分数由6.63%提高到72.35%。
［参考文献］
［1］陈飞，陈卓，邢雪飞，等.肉苁蓉的研究进展［J］.药物评价研究，2013，36（6）：469-475.
［2］杨峻山.沙漠人参——肉苁蓉［J］.中国药学杂志，2011，46 （12）：881.
［3］颜贵卉，田金虎，龙本文，等.肉苁蓉中苯乙醇苷类成分的研究进展［J］.中南药学，2012，10（9）：692-695.
［4］王慧.黄酮类化合物生物活性的研究进展［J］.食品与药品，2010，12（9）：347-350.
［5］宋阳.肉苁蓉中黄酮类化合物的提取及抗氧化性能研究［J］.辽宁化工，2013，42（1）：13-15.
［6］孙萍，李艳，杨秀菊.肉苁蓉总黄酮的微波提取及含量测定［J］.现代中药研究与实践，2003，17（2）：28-29.
［7］张夏辉.鸡血藤中黄酮类化合物提取及抗氧化性的研究［D］.柳州：广西科技大学，2013.
［8］张妍，李厚伟，张永春，等.山植中总黄酮几种提取分离方法的考察及含量测定［J］.哈尔滨医科大学学报，2001，35 （3）：183-184.
［9］常楚瑞.乙酸乙酯回流法提取木瓜总黄酮及含量测定［J］.贵阳医学院学报，2001，26（4）：326-327.
［10］Wei SS，Yang M，Chen X，et al.Simultaneous determination and assignment of 13 major flavonoids and glycyrrhizic acid in licorices by HPLC-DAD and Orbirap mass spectrometry analyses［J］.Chin JNat Med，2015，13（3）：232-240.
［11］陈水英，孙彩华.大孔吸附树脂在天然药物有效成分分离、富集中的应用［J］.中国药业，2007，16（18）：63-64.
［12］李淑珍，李进，杨忐江，等.人孔树脂分离纯化黑果枸杞总黄酮的研究［J］.食品科学，2009，30（1）：19-24．
［13］Lei L，Song ZH，Peng-Fei TU.Advances in research of chemical constituents in plants of Cistanche Hoffing.et Link［J］.Chin Tradit Herbal Drugs，2003，34（5）：473-476.
［14］Jiang Y，Tu PF.Analysis of chemical constituents in Cistanche species［J］.JChromatogr A，2009，1216（11）：1970-1979.
Study on app lication of macroporous resin in separation and purification of the total flavonoids in herba Cistanche
XU Chang-yong1YANG Kai2
1.Inspection and Testing Center of Pingyi County in Shandong Province，Pingyi　273300，China；2.School of Food，Beijing Technology and Business University，Beijing　100048，China
［Abstract］Objective Tomake use of the principle of adsorption and desorption and conduct the static adsorption experiment so as to study the AB-8 macroporous adsorption resin′s adsorption and desorption of the total flavonoids in herba Cistanche.Methods The optimum separation and purification conditions were obtained through dynamic adsorption experiment and orthogonal tests.Results The concentration，flow rate and the best adsorption condition of sample solution was 1.5mg/ml，3ml/min and pH=6；80%ethanolwas eluted with the flow rate of 3 ml/min，and 12 times of the column bed volume was used as the optimal desorption conditions.Conclusion The technical process proves its stability and feasibility in separation and purification of the total flavonoids content in herba Cistanche，which elevates the postseparation-and-purification total flavonoids from 6.63%to 72.35%and is suitable for industrial production.
［Key words］Cistanche；Total flavonoids；Macroporous resin；Separation and purification
［中图分类号］R286.0
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）08（c）-0130-05
（收稿日期：2016-06-28本文编辑：方菊花）