RP-HPLC法测定益肾固本胶囊中马钱苷的含量
李　君　李俊雅　吴梅青
湘潭医卫职业技术学院，湖南湘潭　411102
［摘要］目的 建立益肾固本胶囊中马钱苷的测定方法。方法 采用菲罗门ODS（250mm×4.6mm，4μm），流动相为乙腈-水（20∶80）；流速1ml/min；检测波长240 nm。结果 马钱苷在4.65～21.75μg之间的线性关系良好，平均加样回收率为99.2%，RSD为3.75%。结论 该方法重复性好，结果准确，可用于益肾固本胶囊的内在质量控制。
［关键词］益肾固本胶囊；马钱苷；高效液相色谱法
益肾固本胶囊（湘药制字Z04000798）是湘潭市金桥中医院制剂室独家配方，由人参、山茱萸、蛤蚧、熟地、核桃仁等10位中药材组成的中成药，具有补肺纳气、益肾固本、平喘止咳之功效，临床上主要用来治疗慢性支气管炎、支气管哮喘、肺气肿缓解期，疗效显著。现代药理实验证明，益肾固本胶囊能够提高机体的免疫功能，增强抵抗力。方中主药山茱萸来源于山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb．et Zucc.）的干燥果实，马钱苷为其主要成分。马钱苷能够降低糖尿病小鼠血糖，改善血脂，抑制糖基化终末产物，对细胞的损伤具有保护作用；还可以启动心肌细胞的活性，改变氧化应激，抑制细胞的功能，延长细胞寿命，改善心功能；同时还能够促进大鼠前脂肪细胞的增殖，抑制分化过程中磷酸甘油脱氢酶的升高和脂肪的积聚，进而影响大鼠前脂肪细胞的分化［1-5］。益肾固本胶囊原标准过于简单，为提高本品的质量标准，保证药品的安全有效，本研究参考有关HPLC法测定马钱苷含量的资料［6-10］，采用反相-高效液相法（RP-HPLC）测定。该方法操作简单，结果准确，精密度和重复性均较好。
1　仪器与试药
岛津LC-20AT高效液相色谱仪，SPD-20A型紫外检测器，CTO-10AS vp型柱温箱，CBM-102型工作站。岛津U2201型紫外-可见分光光度计，HS6150D超声提取仪（巩义市化学仪器有限公司）。马钱苷对照品（中国食品药品检验研究院，批号：111640-201509）；益肾固本胶囊为湘潭市金桥中医院制剂室提供（批号20150801、20151008、20151103）；甲醇、异丙醇、乙腈为色谱纯；所用其他（氯仿、乙醚、乙酸乙酯、无水乙醇）试剂均为分析纯。
2　方法与结果
2.1　色谱条件与系统适用性试验
色谱柱菲罗门ODS（250mm×4.6mm，4μm column size）；柱温：25℃；流动相：乙腈-水（20∶80）；流速：1.0 ml/min；检测波长：240 nm；理论塔板数按马钱苷峰计算应≥6000。在此条件下，马钱苷与其他相邻色谱峰分离度＞1.5，且阴性对照对照品无干扰（图1～图3）。

 
图1　马钱苷标准

 
图2　益肾固本胶囊样品

 
图3　阴性对照品
2.2　实验溶液的制备
2.2.1　对照品溶液的制备　精密称取马钱苷对照品4.75mg，加80%甲醇定容到10ml的容量瓶中，制成0.475mg/ml的标准溶液。
2.2.2　供试品溶液的制备　取益肾固本胶囊研细，精密称取0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50ml，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3　阴性对照品溶液的制备　配制缺山茱萸药材的阴性对照品，按照供试品溶液的制备项下同法操作，即得。
2.3　方法学考察
2.3.1　标准曲线的建立　分别从0.475mg/ml的标准溶液中吸取5、10、15、20、25μl，依次进行测定。以峰面积（x）为横坐标，以马钱苷的进样量（y）为纵坐标，建立标准曲线，得回归方程：y=7.128 944x+0.139 064 1，r=0.9998，马钱苷在4.65～21.75μg之间线性关系良好。2.3.2精密度试验　取同一标准品供试品溶液，连续进样5次，计算RSD值，结果见表1。
表1　精密度试验

2.3.3　稳定性试验　同一供试品溶液分别在0、2、4、6、8、12 h测定，计算RSD值，结果见表2。
表2　稳定性试验

2.3.4　重复性试验　平行称取样品5份，按“2.2.2”项下方法制备样品液，进行HPLC分析，计算RSD值，结果见表3。
表3　重复性试验

2.3.5　加样回收率试验　精密称取样品粉末5份，加入一定量的马钱苷对照品，按照“2.2.2”项下方法制备样品液进行HPLC分析，计算加样回收率，结果见表4。
表4　加样回收率试验

2.4　样品测定
取本品研细，取细粉约0.5 g，精密称定。按照上述样品溶液配制方法配制3批样品溶液，分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以外标法计算样品中马钱苷的含量即得，结果见表5。
表5　不同批次益肾固本胶囊中马钱苷的含量

3　讨论
经紫外-可见分光光度计全波长扫描验证，马钱苷在240 nm波长处有最大吸收，同时在此波长处，马钱苷吸收灵敏，基线平稳，且与阴性对照无干扰，故本实验选定240 nm为测定波长［8，10-14］。
在实验中曾选用乙腈-水（30∶70）、甲醇-水（20∶80）、甲醇-水-冰醋酸（80∶20∶0.05）等作流动相，发现分离效果差，理论塔板数不能达到分离目标。经实验摸索，反复调整乙腈-水的比例后，发现采用乙腈-水（20∶80）为流动相，马钱苷峰可以与相邻成分达到基线分离，出峰时间、峰形、柱效均较为满意，且阴性对照无干扰。
益肾固本胶囊由10味中药经现代重要技术提取加工制成，本实验中先后考察了以下3种提取方法。①超声提取：以甲醇为溶剂，提取30min；②加热回流提取：以甲醇为溶剂，提取1 h；③渗滤法：以乙醇为溶剂，连续提取12 h。经紫外-可见光谱法及HPLC法检测，表明以加热回流提取法为最佳。
综上所述，本法简便、快速、易行，结果准确，能有效控制益肾固本胶囊的内在质量。
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Content determination of loganin in Yishenguben capsule by RP-HPLC method
LIJun　LIJun-ya　WU Mei-qing
Xiangtan Medicine and Health Vocational College，Xiangtan　411102，China
［Abstract］ObJective To establish amethod for determination of loganin content in Yishenguben capsule.Methods Shimpack-VP-ODS　（250 mm×4.6 mm，4μm）was used with acetonitrile water（20∶80）asmobile phase，the flow rate was 1.0 ml/min，the detection wavelength was at 240 nm.Results The linear range of loganin from 4.65 to 21.75μg was good，the average recovery ratewas 99.2%，RSD was 3.75%.Conclusion The experiment shows that thismethod has good repeatability and accurate result，and can be used in the capsule product quality control．
［Key words］Yishenguben capsule；Loganin；High performance liquid chromatography
［中图分类号］R927.2
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）08（c）-0008-03
（收稿日期：2016-05-25本文编辑：祁海文）
［基金项目］湖南省教育厅科研资助项目（14C1113）
［作者简介］李君（1983-），男，河南南阳人，药学硕士，讲师，主要从事药品质量标准研究工作