不同人工诱导方法产生龙血竭的镇痛、抗炎效果的比较
罗宇东1　吴玉强1　李　萍2　谭安蔷1　张　强1▲
1.广西中医药大学制药厂，南宁　530001；2.武汉市江岸区商务局，武汉　430000
［摘要］目的研究不同人工诱导方法产生的龙血竭镇痛、抗炎效果。 方法实验资料来源于广西中医药大学制药厂实验室，收集时间为2015年12月，镇痛实验采用扭体实验方法，将80只小鼠随机分为生理盐水组，阿司匹林组（0.5 g/kg），自然产龙血竭小、大剂量组（1 g/kg和2 g/kg），生物诱导龙血竭小、大剂量组（1 g/kg和2 g/kg），化学诱导龙血竭小、大剂量组（1 g/kg和2 g/kg），每组10只，各组按0.1 ml/10 g剂量灌胃给药，1次/d，连续3 d，观察各组药物对化学刺激痛反应的影响（扭体次数、扭体潜伏期、抑制率）；抗炎实验为小鼠50只，随机分为5组，每组10只，即空白对照组（给予同体积蒸馏水）、阿司匹林阳性对照组（0.2 g/kg）、自然产龙血竭组（2 g/kg）、生物诱导龙血竭组（2 g/kg）、化学诱导龙血竭组（2 g/kg），采用二甲苯致小鼠耳肿胀法，连续灌胃给药7 d，1次/d。于末次给药后1 h，在小鼠右耳涂20 μl的二甲苯致炎。1 h后处死动物，剪下双耳，用6 mm打孔器切下双耳片称重，以右耳重量减去左耳重，观察其抗炎效果（耳肿胀程度）。　结果扭体实验：自然产龙血竭大、小剂量组，生物诱导龙血竭大、小剂量组，化学诱导龙血竭大、小剂量组，阿司匹林组的扭体次数分别为（9.01±6.87）、（10.05±7.87）、（10.51± 6.37）、（11.05±7.57）、（10.39±7.35）、（10.15±7.12）、（10.00±4.57）次，与生理盐水组［（21.10±10.62）次］比较，差异有统计学意义（P＜0.01），提示其能明显抑制小鼠的扭体次数；自然产龙血竭大、小剂量组，生物诱导龙血竭大、小剂量组扭体镇痛作用与阿司匹林组相似（P＞0.05）；生物诱导龙血竭剂量组，化学诱导龙血竭剂量组与自然产龙血竭剂量组扭体次数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。抗炎实验：自然产龙血竭剂量组、生物诱导龙血竭剂量组、化学诱导龙血竭剂量组、阿司匹林组、空白对照组耳肿胀度分别为（7.8±2.3）、（7.3±2.6）、（7.5±2.8）、（7.0±2.2）、（11.2± 2.4）mg，龙血竭给药各组、阿司匹林组耳肿胀度与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；生物诱导龙血竭剂量组，化学诱导龙血竭剂量组耳肿胀度与自然产龙血竭剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论不同人工诱导产龙血竭镇痛、抗炎效果差异不明显。
［关键词］人工诱导龙血竭；镇痛；抗炎
龙血竭为百合科植物剑叶龙血树［Dracaena cochinchinensis（Lour.）S.H.Chen］含脂木质部经提取加工制成的树脂，具有活血散瘀、消炎止痛、收敛止血、生肌敛疮、补血益气等功效［1-4］。剑叶龙血树在自然环境下生长产生的龙血竭树脂产量少，生产周期长，且剑叶龙血树药材由于过度采伐而日益匮乏。目前国内已开展了采用人工诱导（生物诱导、化学诱导）方法产生龙血竭的相关研究［5-8］，但人工诱导方法产生的龙血竭是否能够替代自然产龙血竭，仍需在活性成分、药理药效、毒理、临床效果等方面开展一致性评价研究。本文研究不同人工诱导产龙血竭镇痛、抗炎作用，以期为人工诱导龙血竭的合理开发和利用提供依据。
1　材料与方法
1.1　动物
昆明系小鼠，体重18～22 g，雌雄各半，清洁级，合格证号：SCXK桂2014-0002，购自广西医科大学实验动物中心。饲养于相对湿度为（60±10）%，温度为20～25℃的环境中，自由饮水，颗粒饲料喂养。
1.2　试药
生物诱导龙血竭的制备，按文献方法［5-6］将9568D镰孢霉接种于剑叶龙血树材质后，将诱导生成的红色树脂药材用95%乙醇回流提取，得生物诱导龙血竭（批号：20150801）；化学诱导龙血竭的制备，按文献方法［7-8］选择10%的草酸作为化学诱导剂，将诱导剂注入龙血树枝干中，诱导生成的红色树脂药材用95%乙醇回流提取，得化学诱导龙血竭（批号：20150701）；自然产龙血竭（芒果牌，批号：20141101）。以上产品均由广西中医药大学制药厂提供，实验前用50%二甲基亚砜将各试药分别配制成所需的浓度；阿司匹林肠溶片，北京曙光药业有限责任公司，生产批号：20140607，粉碎后以注射用水加吐温-80助溶配制成混悬液，备用。
1.3　主要仪器
BS224S型电子天平 （北京赛多利斯）；RE501旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限公司），HH-6数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司），101-1恒温电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.4　小鼠扭体镇痛实验
取昆明种小鼠80只，体质量18～22 g，雌雄各半，随机分为生理盐水组，阿司匹林（50 mg/ml），自然产龙血竭小、大剂量组（1 g/kg和2 g/kg），生物诱导龙血竭小、大剂量组（1 g/kg和2 g/kg），化学诱导龙血竭小、大剂量组（1 g/kg和2 g/kg），每组10只，各组按0.1 ml/10 g剂量灌胃给药，1次/d，连续3 d。末次给药1 h后，各鼠分别腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 ml/10 g（醋酸溶液临用前配制），观察并记录注射醋酸溶液后15 min内各组发生扭体反应（腹部收缩内凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行）的鼠数和各鼠扭体次数［9-10］。扭体反应抑制百分率（%）=（对照组平均扭体数-给药组平均扭体数）/对照组平均扭体数×100%。
1.5　小鼠抗炎作用实验
采用小鼠二甲苯所致耳肿胀实验。取体质量为18～22 g小鼠50只，随机分为5组，每组10只，即空白对照组（给予同体积蒸馏水）、阿司匹林阳性对照组（0.2 g/kg）、自然产龙血竭组（2 g/kg）、生物诱导龙血竭组（2 g/kg）、化学诱导龙血竭组（2 g/kg），连续灌胃给药7 d，1次/d。于末次给药后1 h，在小鼠右耳涂20 μl二甲苯致炎。1 h后处死动物，剪下双耳，用6 mm打孔器切下双耳片称重，以右耳重减去左耳重，观察其肿胀程度［9-10］。
1.6　统计学方法
采用统计软件SPSS 18.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　各组小鼠扭体镇痛实验的比较
自然产龙血竭大、小剂量组，生物诱导龙血竭大、小剂量组，化学诱导龙血竭大、小剂量组与生理盐水组比较，能明显抑制小鼠的扭体次数（P＜0.01），其扭体镇痛作用与阿司匹林组相似（P＞0.05）；生物诱导龙血竭剂量组、化学诱导龙血竭剂量组与自然产龙血竭剂量组扭体镇痛作用比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。
表1　不同人工诱导产龙血竭对小鼠醋酸扭体反应的影响（±s，n=10）

 
与生理盐水组比较，**P＜0.01
2.2　不同人工诱导产龙血竭对小鼠耳肿胀的影响
自然产龙血竭剂量组（2 g/kg）、生物诱导龙血竭剂量组（2 g/kg）、化学诱导龙血竭剂量组（2 g/kg）和阿司匹林组能明显抑制小鼠耳肿胀（P＜0.05），具有较好的抗炎作用；生物诱导龙血竭剂量组、化学诱导龙血竭剂量组与自然产龙血竭剂量组比较，抗炎作用差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。
表2　不同人工诱导产龙血竭对小鼠耳肿胀的影响（±s，n=10）

 
与空白对照组比较，*P＜0.05
3　讨论
龙血竭属于树脂类药材，是贵重中药进口血竭的国产替代品，剑叶龙血树为龙血竭的来源植物，收载于《广西壮族自治区壮药质量标准》，壮药名为榧勒垄，具有定痛止血、敛疮生肌、活血散瘀等功效，用于瘀血作痛、跌打损伤、外伤出血、妇女气血凝滞和脓疮久不收口等。剑叶龙血树多分布于石灰岩地区，生长缓慢，自然环境下剑叶龙血树需生长十几年，甚至几十年才可能用来生产血竭，自然产脂率低，群体扩增能力差。随着市场对龙血竭需求的增长，剑叶龙血树资源严重不足。龙血竭在剑叶龙血树中的形成机制尚不清楚，国内大多学者认为龙血竭是剑叶龙血树树干受到损伤后在微生物的侵染和（或）自然氧化作用下逐渐形成的，通过实验研究认为虫蛀、镰刀菌与树脂形成有相关性。目前国内已开展了采用人工诱导（生物诱导、化学诱导）方法产生龙血竭的相关研究，但人工诱导的龙血竭能否作为自然生长龙血竭的替代品，还需作进一步的系统考察［12-21］。
本文研究不同人工诱导产龙血竭镇痛、抗炎作用，镇痛实验结果表明，自然产龙血竭、生物诱导龙血竭、化学诱导龙血竭能明显抑制小鼠的扭体次数，其镇痛作用与阿司匹林相似；生物诱导龙血竭，化学诱导龙血竭与自然产龙血竭比较，镇痛作用差异无统计学意义。抗炎实验表明，自然产龙血竭、生物诱导龙血竭、化学诱导龙血竭和阿司匹林均能明显抑制小鼠耳肿胀，具有较好的抗炎作用；生物诱导龙血竭、化学诱导龙血竭与自然产龙血竭比较，抗炎作用差异无统计学意义。不同人工诱导产龙血竭镇痛、抗炎作用效果的比较研究，为人工诱导产龙血竭在临床方面的广泛应用提供了理论依据。
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ComParison of analgesic and anti-Inflammatory effect of Resina Draconis generated by different artificial induction methods
LUO Yu-dong1WU Yu-qiang1LI Ping2TAN An-qiang1ZHANG Qiang1▲
1.Pharmaceutical Factory，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning　530001，China；2.Jiangan District Bureau of Commerce of Wuhan，Wuhan　430000，China
［Abstract］Objective To make an investigation on the comparison of analgesic and anti-inflammatory effects of Resina Draconis generated by different artificial induction methods.Methods The experimental data was derived from the laboratory of pharmaceutical factory of Guangxi University of TCM，which was collected in December 2015.The writhing test method was adopted in the analgesic test that recruited and divided 80 mice into 8 groups randomly and evenly with 10 mice in each group，including Saline Group，Aspirin Group　（0.5 g/kg），Large-Dosage Natural Group and Small-Dosage Natural Group（naturally-produced Resina Draconis with small dosage and with large dosage，1 g/kg and 2 g/kg），Large-Dosage Biological Group and Small-Dosage Biological Group　（biological-induction-produced Resina Draconis with small dosage and with large dosage，1 g/kg and 2 g/kg），Large-Dosage Chemical Group and Small-Dosage Chemical Group（chemicalinduction-produced　Resina　Draconis　with　small dosage and with large dosage，1 g/kg and 2 g/kg）.The drug was administered orally to mice in each group atthe dose of 0.1 ml/10 g，1 time a day，for 3 consecutive days，the effect of each drug on chemically-stimulated pain reactions（the number of writhing times，writhing latency and the inhibition rate）were observed.As for the anti-inflammatory test，50 mice were recruited and divided into 5 groups randomly and evenly with 10 mice in each group，including Control Group　（administered with the same volume of distilled water），Aspirin Positive Control Group　（0.2 g/kg），Natural Group（naturally-produced Resina Draconis，2 g/kg），Biological Group（biological-induction-produced Resina Draconis，2 g/kg）and Chemical Group　（chemical-induction-produced Resina Draconis，2 g/kg）.The drugs were continuously and intragastrically administered to all the mice one time a day，for 7 days.The right ears of all the mice were coated with 20 μl xylene 1 hour after the last administration to make all the mice′s right ears swelling.All the mice were killed 1 hour later and their ears were cut off.Then，the ear flaps were cut off with a 6 mm punch and weighed to calculate the weight gaps between the right ear and the left ear and observe the anti-inflammatory effect（the swelling degree of ears）.Results According to the writhing test results，the number of writhing times in Large-Dosage Natural Group and Small-Dosage Natural Group，Large-Dosage Biological Group and Small-Dosage Biological Group，Large-Dosage Chemical Group and Small-Dosage Chemical Group as well as Aspirin Group were（9.01±6.87），（10.05±7.87），（10.51±6.37），（11.05± 7.57），（10.39±7.35），（10.15±7.12），（10.00±4.57）times versus Saline Group′s of（21.10±10.62）times，which showed obvious inhibitory effects on the number of writhing times（P＜0.01）in all the groups except Saline Group.Large-Dosage Natural Group，Small-Dosage Natural Group，Large-Dosage Biological Group，Small-Dosage Biological Group，Large-Dosage Chemical Group and Small-Dosage Chemical Group demonstrated similarities with Aspirin Group in the analgesic effects（P＞0.05）.No significant difference was seen between the writhing frequency of Large-Dosage Natural Group，Small-Dosage Natural Group，Large-Dosage Biological Group，Small-Dosage Biological Group，Large-Dosage Chemical Group and Small-Dosage Chemical Group　（P＞0.05）.As for the anti-inflammatory experiment，the swelling degree of ears in Natural Group，Biological Group，Chemical Group，Aspirin Positive Control Group and Control Group were（7.8±2.3），（7.3± 2.6），（7.5±2.8），（7.0±2.2），（11.2±2.4）mg respectively，with the existence of significant difference between Control Group and the other four groups（P＜0.05）.There was no significant difference between the anti-inflammatory effect of Natural Group，Biological Group and Chemical Group　（P＞0.05）.Conclusion Resina Draconis generated by different artificial induction methods proves itself with no significant difference in anti-inflammatory and analgesic effects.
［Key words］Artificial-induction-produced resina draconis；Analgesia；Anti-inflammatory
［中图分类号］R285.5
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）05（c）-0087-04
［基金项目］广西科学研究与计划开发计划项目（桂科重135 5001-5-10）；广西壮族自治区教育厅科研项目（201204LX2 09）；广西中医药大学自然科学研究课题（P2012067）
［作者简介］罗宇东（1974-），男，汉族，硕士，副主任药师，研究方向：从事壮瑶新药的研究与开发
▲通讯作者：张强，男，汉族，主治医师，从事中医临床应用及药理药效学研究
（收稿日期：2016-04-21本文编辑：卫 轲）