血清miR-1检测在急性心肌梗死早期诊断中的临床意义
周子健　崔秀平　冯可清　马　坤
吉林省梅河口市中心医院心内科，吉林梅河口　135000
［摘要］目的研究miR-1检测在急性心肌梗死（AMI）患者早期血清中的表达水平，探讨其作为急性心肌梗死早期诊断标志物的可能性和临床意义。方法选择2013年7月～2014年7月在我院心内科接受治疗的40例AMI患者、40例心绞痛患者和40例正常人作为研究对象，在胸痛发作后1、2、6、12、24 h收集血清标本。采用实时荧光定量RT-PCR检测血清miR-1、肌酸激酶同工酶（CK-MB）和肌钙蛋白I（cTnI）的表达。分析血清miR-1的表达水平与CK-MB和cTnI的相关性，探讨血清miR-1的表达水平在早期诊断AMI上的临床价值。结果AMI患者血清中miR-1表达相对水平为1.77±0.52，显著高于正常人（0.19±0.04）和心绞痛患者（0.57±0.09）（P＜0.05）。发病后血清miR-1迅速升高，在胸痛发作后12 h左右达到高峰；Pearson相关分析结果显示AMI患者血清miR-1的表达与CK-MB、cTnI呈正相关（P＜0.05）。 结论miR-1在AMI患者血清中高表达，能够很好地反映AMI心肌损伤，可能成为新的AMI检测标志物。
［关键词］血清miR-1；急性心肌梗死；临床意义
近年来随着心血管疾病发病率的逐渐升高，急性心肌梗死（AMI）由于其在心血管疾病中很高的发病率及死亡率而严重影响人们的身体健康和生活质量［1-2］。早期和确切的诊断急性心肌梗死，对于积极采取有效的治疗措施，减少患者死亡率以及良好的预后起着决定性作用。微小RNA（miRNA）是近年来发现的一类长度为20～25 nt的非编码调控单链小分子RNA。研究显示，其具有降解靶标基因mRNA或抑制其翻译的特性，因而在调控细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生理病理过程中起着非常重要的调控作用［3-4］。最新的研究证实，miRNAs能在血液中稳定存在，且其表达谱和表达水平改变情况也与相应的疾病有关。因此，科学家们推测miRNA可能是一个理想的生物检测标志物［5-6］。miR-1是目前已知的主要表达于骨骼肌和心肌组织中的miRNA［7］。本次研究笔者通过检测AMI患者血清miR-1的表达水平，并与心绞痛患者和正常人血清中miR-1表达情况进行对比，探讨miR-1在AMI早期诊断中的应用价值。
1　资料与方法
1.1　一般资料
选择2013年7月～2014年7月在我院心内科接受治疗的40例AMI患者作为研究对象。所有AMI患者均符合心肌梗死的诊断标准。其中男性31例，女性9例，年龄44～72岁，平均年龄（58.5±7.6）岁；均为自述胸痛发作后1 h内入院。另选择40例心绞痛患者和40例正常人作为对照。所有患者研究前均被告知签署知情同意书。
1.2　主要设备及试剂
RNAisoTMPlus和RT-PCR试剂盒 （Takara公司）；mirVanaTMmiRNAIsolationKit和miScriptReverseTranscription Kit（Ambion公司）；miR-1及U6引物序列购于上海吉凯基因化学技术有限公司；微量高速离心机（Eppendorf公司）；ABI PRISM 7900实时荧光定量PCR仪（ABI公司）。
1.3　血清样本采集
所有研究对象均在胸痛发作后1、2、6、12、24 h采集静脉血5 ml，室温下自然凝固20 min，然后2000 r/min条件下离心15 min，吸出上层血清，放入-80℃冰箱待实验。
1.4　miR-1的检测
1.4.1　血清总RNA提取 采用RNAisoTMPlus并按照操作说明提取血清中的总RNA，异丙醇沉淀法浓缩RNA，NanoDropRND-1000检测RNA浓度并评估纯度，1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。
1.4.2　反转录（RT）反应 采用miScript Reverse Transcription Kit并按照实验步骤说明进行操作。建立20 μl RT混合反应体系：dNTP（2.5 mmol/L）2 μl；Total RNA 0.3 μg；RT特异引物 （1 μmol/L）：0.5 μl；MMLV反转录酶（10 U/μl）：2μl；RNA酶抑制剂（40 U/μl）：0.3 μl；10×RT Buffer 2 μl；加入无RNA酶水至总体积20 μl。反应条件：16℃，30 min；40℃，40 min；85℃，5 min。
1.4.3　PCR构建20 μl反应体系：通用引物1 μl，目的引物1 μl，QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，模板CDNA 1 μl，无RNA酶水7 μl。按以下程序进行扩增：95℃，3 min；40个PCR循环（95℃，15 s；60℃，20 s；72℃，20 s；77℃，20 s），收集荧光。实验重复3次。数据采用2-ΔΔCT法对miR-1表达进行分析。
1.5　统计学处理
采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验。相关性采用Pearson相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　RNA质量检测结果的统计
提取血清RNA经检测吸光度（A）值A260/A280在1.6～1.8，表明RNA浓度和纯度较高，无DNA及蛋白质污染。变性凝胶电泳结果显示为3个清晰条带，18 S 和28 S条带清晰无明显拖尾，证实RNA提取成功，无RNA降解发生（图1）。

 
图1　变性凝胶电泳结果
血清总RNA
2.2　AMI患者、心绞痛患者和正常人血清miR-1表达情况的比较
正常人血清中miR-1表达相对水平很低，仅为0.19±0.04；心绞痛患者血清miR-1表达水平较正常人有比较明显的升高，为0.57±0.09；而AMI患者血清miR-1表达水平则最高，为1.77±0.52，显著高于正常人和心绞痛患者（P＜0.05）（图2）。

 
图2　各组血清miR-1表达情况的比较
与正常人比较，*P＜0.05
2.3　不同时间点AMI血清miR-1的表达情况
AMI患者胸痛发作后血清miR-1迅速升高，在胸痛发作后1 h血清miR-1表达即可出现明显升高，12 h左右达到高峰（图3）。

 
图3　不同时间点AMI血清miR-1的表达情况
2.4　血清miR-1的表达与肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）的相关性分析
Pearson相关分析结果显示，AMI血清中miR-1的表达与CK-MB、cTnI呈正相关（r=0.71，r=0.74，P＜0.05）。
3　讨论
目前临床上最常用的诊断AMI的生物标志物主要有cTn、CK-MB等。CK-MB主要存在于心肌组织中，AMI患者胸痛发作后4～6 h，患者血清中CK-MB浓度水平即开始升高，曾被认为是诊断AMI的金标准［8］。cTn为心肌肌肉收缩的调节蛋白，正常人血液中cTn含极微量，当心肌受损时，cTn会大量释放到血液中导致血液循环中cTn浓度水平升高。研究显示，心肌受损后3～5 h，患者血液中可以检测到cTnI呈阳性，因而是目前心肌损伤最具特异度的标志物［9］。但上述生物标志物在诊断AMI中并非尽善尽美，其在AMI发生的2～4 h内灵敏度较低。AMI患者往往为等待血清相关生化标志物的检查结果而延误疾病的治疗。因此，寻找能早期诊断AMI，且特异度、灵敏度更高的标志物是非常有必要的。
大量的研究证实，miRNA与各种疾病的发生及发展密切相关，且在患者病变组织、血液中均可以发现异常表达的、与疾病发展密切关联的miRNAs［10］，如恶性肿瘤患者（多发性骨髓瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌等）血液中均被证实有异常表达的、与肿瘤相关的miRNA的存在［11-12］。近年来随着心血管相关miRNA研究取得的重大进展，越来越多在心肌细胞中特异度表达的miRNAs（如miR-1、miR-208、miR-21等）被发现。这些miRNAs不仅对心脏的发育有着精细调控，还在心血管系统的病理生理过程中起重要作用［13］。miR-1是心肌组织中富含的一种miRNA。研究显示，miR-1参与调控心脏发育、心肌肥厚、心律失常和心肌缺血等多种病理过程［14］。Cheng等［15］在构建大鼠心肌梗死模型的研究中发现，大鼠血清miR-1在发生心肌梗死后迅速表达，并在梗死后6 h达高峰。由于蛋白类标志物必须由mRNA翻译过来才能具备生物学效应。因此，miRNA的特性使得miRNA标志物能更早、更直接地反映机体生理和病理状况。因此，以上研究提示miR-1可能成为诊断心肌梗死新的标志物。
本次研究笔者采用RT-PCR检测AMI患者血清miR-1的表达水平改变情况，结果发现AMI患者血清miR-1表达水平要明显高于心绞痛患者和正常人，且心绞痛患者血清miR-1的表达水平也要高于正常人，提示血清miR-1在鉴别AMI上具有较高的准确性。通过进一步对AMI发病后不同时间点患者血清miR-1的表达水平进行研究，发现在胸痛发作后1 h血清miR-1表达即可出现明显升高，12 h左右达到高峰；Pearson相关分析结果显示AMI患者血清中miR-1的表达与CK-MB和cTnI呈明显正相关。可见，血清miR-1可能成为早期诊断和正确评估AMI严重程度的新指标。
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Clinical meaning of serum miR-1 in the early diagnosis of acute myocardium infarction
ZHOU Zi-jian　CUI Xiu-ping　FENG Ke-qing　MA Kun
Department of Cardiology，Meihekou Central Hospital in Jilin Province，Meihekou　135000，China
［Abstract］Objective To study the early expression level of miR-1 in AMI patients and to explore the possibility and clinical meaning of it for the early diagnosis standard for AMI.Methods 40 AMI patients，40 anginal patients and 40 health people from July 2013 to July 2014 of cardiology department in our hospital were selected.The serum samples were collected at 1，2，6，12 and 24 hours after acute chest pain.The expression of serum miR-1，CK-MB and cTnI were tested by using RT-PCR.The relationship between serum miR-1，CK-MB and cTnI was analyzed.The clinical value of serum miR-1 expression level in early diagnosis AMI was explored.Results The relative expression level of serum miR-1 in AMI patients was 1.77±0.52，obvious higher than that were respectively 0.19±0.04 and 0.57±0.09 in health people and anginal patients　（P＜0.05）.After the onset of illness，the serum miR-1 increased fast and reached a peak around 12 h after the onset of chest pain；Pearson relevant analysis showed that serum miR-1 expression of AMI patients had positive relationship with CK-MB and cTnI（P＜0.05）.Conclusion MiR-1 in AMI patients with high expression，which can well reflect the AMI myocardial injury and can be a new measuring marker for AMI.
［Key words］Serum miR-1；Acute myocardium infarction；Clinical significance
［中图分类号］R542.22
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）05（c）-0124-03
（收稿日期：2016-03-01本文编辑：卫 轲）