乌司他丁对侵袭性念珠菌感染小鼠肝脏线粒体功能的保护作用
李小悦
广东省东莞市塘厦医院重症医学科，广东东莞　523710
［摘要］目的探讨乌司他丁对侵袭性念珠菌感染小鼠肝脏线粒体功能的保护作用和可能机制。 方法雄性昆明小鼠60只，经CTX预处理后腹腔注射白念珠菌混悬液，制作侵袭性念珠菌感染小鼠模型，随机分成对照组（n= 20）、乌司他丁低剂量组（n=20）和乌司他丁高剂量组（n=20）。对照组给予抗真菌药物治疗，低剂量组给予抗真菌药物联合乌司他丁（1×104U/kg）治疗，高剂量组给予抗真菌药物联合乌司他丁（5×104 U/kg）治疗，观察3组第7天生存率、第7天线粒体生成指标、第7天氮化应激指标和第7天肝脏病理。　结果高剂量组第7天生存率显著高于对照组（70%vs 30%，P=0.011），第7天高剂量组PGC-1α mRNA显著高于低剂量组和对照组（P＜0.05），第7天高剂量组氮化应激指标显著低于低剂量组和对照组（P＜0.05）。光镜下第7天高剂量组小鼠肝脏肝窦充血较对照组减轻。结论高剂量乌司他丁可能通过抑制氮化应激保护侵袭性念珠菌感染小鼠肝脏线粒体功能，促进肝细胞线粒体生成。
［关键词］侵袭性念珠菌感染；乌司他丁；线粒体；氮化应激
侵袭性念珠菌感染是脓毒症最常见的病因之一，容易发展为多器官功能不全综合征，其中肝脏是最常见的受损器官之一［1］。乌司他丁（ulinastatin，UTI）是从人尿中分离纯化的蛋白酶抑制剂，已被广泛应用于治疗全身炎症反应综合征和感染的器官功能保护［2-3］。研究证实，UTI可以改善侵袭性念珠菌感染小鼠第7天生存率，减轻侵袭性念珠菌感染所致肝损伤，并提示与保持肝脏线粒体的完整性有关［4］。肝脏线粒体在脓毒症发生和发展中的地位逐渐受到重视，但UTI对侵袭性念珠菌感染小鼠肝脏线粒体功能的保护机制未明［5-6］。本研究通过观察不同剂量UTI对侵袭性念珠菌感染小鼠肝脏线粒体的保护作用，探讨UTI保护侵袭性念珠菌感染小鼠肝脏线粒体可能的作用机制。
1　材料与方法
1.1　动物分组
雄性昆明小鼠60只，由中山大学实验动物中心提供［SCXK（粤）2009-0011］，平均（21.2±3.2）g。按随机数字表法分为对照组、低剂量组、高剂量组，每组20只。
1.2　侵袭性念珠菌感染小鼠模型的制备［4，7］
实验前2 d环磷酰胺处理。第1天腹腔注射环磷酰胺200 mg/kg，第2天腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg，以后每4天腹腔注射100 mg/kg。用生理盐水将白色念珠菌（白色念珠菌标准菌株ATCC90028，中山大学中山医学院微生物教研室提供，经沙保弱培养基37℃培养48 h）配制成1×109CFU/ml混悬液，腹腔注射制作侵袭性念珠菌感染动物模型。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。对照组、低剂量组和高剂量组均给予伊曲康唑口服液 （西安杨森制药有限公司，50 mg/kg，Q12 h，稀释成1 ml生理盐水）治疗。在抗真菌治疗的基础上，低剂量组给予UTI（1×104U/kg）治疗，高剂量组给予UTI（5×104U/kg）治疗。
1.3　检测指标［8-9］
第7天处死小鼠，观察3组第7天生存率、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子（peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）、氮化应激指标（NO、总NOS、iNOS）和光镜检查。
1.3.1　菌落计数 取双肾无菌匀浆，5 ml生理盐水稀释，取上清液5 ml接种于沙保弱培养基37℃培养48 h，进行菌落计数。
1.3.2　表达丰度检测 采用荧光定量RT-PCR方法检测PGC-1α mRNA的表达丰度。
1.3.3　氮化应激指标检测 采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒检测小鼠肝脏组织氮化应激各项指标。取制备好的肝脏组织匀浆，严格按照各试剂盒内说明书操作，通过比色法测定各管的吸光度后，利用公式计算各项指标值［10-11］，包括NO、总NOS、iNOS。每毫克组织蛋白酶每分钟生成1 nmol NO为一个酶活力单位。
1.4　统计学处理
采用SPSS 13.0软件包对数据进行处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示，数据呈正态分布者采用方差分析，组间比较采用q检验；数据非正态分布或方差不齐，采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
建模后2 d内，小鼠未出现明显异常。之后小鼠出现精神萎靡、活动和进食减少。建模后3 d各组双肾匀浆培养可找到白色念珠菌。
2.1　3组生存率的比较
对照组、低剂量组和高剂量组第7天生存率分别为30%、45%、70%。高剂量组第7天生存率显著高于对照组，差异有统计学意义（P=0.011）。高剂量组与低剂量组之间、低剂量组与对照组间差异无统计学意义（P值分别为0.075和0.070）。
2.2　3组PGC-1α和氮化应激指标的比较
第7天高剂量组PGC-1α mRNA显著高于对照组和低剂量组 （P＜0.05），第7天低剂量组PGC-1α mRNA与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。第7天高剂量组氮化应激指标显著低于对照组和低剂量组（P＜0.05），第7天低剂量组氮化应激指标与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。
表1　3组PGC-1α和氮化应激指标的比较（±s）

 
与对照组和低剂量组比较，*P＜0.05
2.3　光镜病理
对照组肝窦充血、肝细胞肿胀、部分呈空泡样改变，可见少量白细胞移行。高剂量组空泡样改变较对照组减轻（图1）。

 
图1　肝脏光镜
a：对照组（×20）；b：对照组（×40）；c：高剂量组（×20）；d：高剂量组（×40）
3　讨论
近年来，肝细胞线粒体在脓毒症发生和发展中的地位逐渐受到重视［10］。脓毒症早期，肝细胞线粒体即出现结构和功能的改变；脓毒症恢复过程中，线粒体生物发生参与脓毒症机体修复过程［11］。文献［6］证实，UTI可以抑制细菌所致脓毒症时的肝脏损害。我们的前期研究显示，UTI可以改善侵袭性念珠菌感染小鼠第7天生存率，并减轻侵袭性念珠菌感染所致肝脏损伤，并提示与保持肝脏线粒体功能有关［4］。
UTI是从人尿中分离纯化的蛋白酶抑制剂。当人体受到感染、应激、休克等情况时，人体尿液中UTI活性升高；随着机体的恢复，UTI活性恢复正常。这表明UTI具有抵抗外来刺激、减少外界损伤因子对机体的损害、维持人体内环境稳定的作用［3］。前期研究结果显示，UTI减轻组织损伤的临界剂量为15 000～20 000 U/kg，效果与剂量呈正相关［4］。本研究中，通过腹腔注射环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型，符合临床侵袭性念珠菌感染的实际，通过组织培养确定模型建立成功。结合前期研究，低剂量组和高剂量组分别采用10 000 U/kg 和50 000 U/kg。
近年研究表明，PGC-1α在线粒体发生过程中发挥关键作用，是线粒体功能恢复的重要指标［12］。本研究中，高剂量组第7天生存率显著高于对照组，第7天高剂量组PGC-1α mRNA显著高于低剂量组和对照组，第7天高剂量组氮化应激指标显著低于低剂量组和对照组，并得到组织病理学验证，提示50 000 U/kg UTI可以保护侵袭性念珠菌感染小鼠肝脏线粒体功能，促进肝细胞线粒体的生成，机制可能是抑制氮化应激。本研究结果发现，UTI不仅可以改善侵袭性念珠菌感染小鼠生存率，还可以提高PGC-1α水平，并且呈剂量依赖性，提示UTI可以促进侵袭性念珠菌感染小鼠肝细胞线粒体生物发生，PGC-1α可能成为侵袭性念珠菌感染肝损害的治疗靶点。
脓毒症早期炎症因子的级联反应和迅速大量产生和释放是线粒体损伤的主要机制［13］。脓毒症时，会产生大量的ROS，与多种生物分子、脂质膜作用，从而导致线粒体损伤，临床表现为组织器官受损和多器官功能不全［14-15］。脓毒症患者的重要器官普遍存在iNOS表达增加，导致NO产生增加、蛋白质的NO修饰、诱导线粒体损伤［10］。本研究结果发现，UTI可以降低侵袭性念珠菌感染小鼠氮化应激水平，并呈剂量依赖性，提示UTI通过抑制氮化应激水平促进侵袭性念珠菌感染小鼠肝细胞线粒体生物发生。脓毒症后线粒体的生物发生可能与细胞病性缺氧的改善关系，尤其是侵袭性念珠菌感染后线粒体的生物发生与细胞病性缺氧改善的关系，尚待进一步探索研究。
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Protective effect of ulinastatin on liver mitochondrial function in mice infected by invasive Candida
LI Xiao-yue
ICU，Tangxia Hospital of Dongguan City in Guangdong Province，Dongguan　523710，China
［Abstract］Objective To discuss the protective effect of ulinastatin on liver mitochondrial function in mice infected by invasive Candida and its possible mechanism.Methods 60 male Kunming mice were given intraperitoneal injection of Candida albicans suspension after pretreatment by CTX and then made into models infected by invasive Candida and were randomly divided into control group（n=20），ulinastatin low-dose group（n=20），and ulinastatin high-dose group（n= 20）.Mice in the control group were given antifungal therapy，mice in the low-dose group were given antifungal drug combined with ulinastatin　（1×104U/kg），while mice in the high-dose group were given antifungal drug combined with ulinastatin　（5×104U/kg）.The survival rate，mitochondriopoiesis index，nitrosative stress index and hepatic pathology of three groups on the 7thday were observed.Results The 7thday survival rate was significantly higher in the high-dose group than that in the control group（70%vs 30%，P=0.011）.On the 7thday，the level of PGC-1α mRNA was significantly higher in the high-dose group than that in the low-dose group and the control group　（P＜0.05），the nitrosative stress index on the 7thday was significantly lower in the high-dose group than in the low-dose group and the control group （P＜0.05）.Congestion of hepatic sinusoid observed by light microscope on the 7thday was slighter in the high-dose group than that in the control group.Conclusion High dose of ulinastatin may protect the liver mitochondrial function and facilitate mitochondriopoiesis in mice infected by invasive Candida via inhibition of nitrosative stress.
［Key words］Invasive Candida infection；Ulinastatin；Mitochondria；Nitrosative stress
［中图分类号］R965.2
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）05（c）-0106-03
（收稿日期：2016-02-07本文编辑：方菊花）