厚朴对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用
胡玥
广州医科大学金域检验学院，广州　511436
［摘要］目的观察厚朴对大鼠心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）的作用，并初步探讨其可能的作用机制。 方法选择健康SD雄性大鼠26只，随机分为三组：假手术组（n=7）、模型组（n=10）、药物组（n=9），通过结扎冠状动脉左前降支30 min后再灌注120 min的方法建立大鼠心肌MIRI模型，每组随机取6只成功造模的大鼠，取其血浆及心肌组织，测定血浆肌酸激酶（CK）、髓过氧化物酶（MPO）和心肌组织中超氧化物歧化酶（SOD）的活力。　结果模型组较假手术组CK活力下降（P＞0.05），MPO活力显著上升（P＜0.05），SOD活力下降（P＜0.05）；药物组较模型组CK与MPO活力均下降（P＜0.05），SOD活力显著上升（P＜0.05）。　结论厚朴对大鼠心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用，其作用机制可能是抗氧化损伤，抑制炎症反应，并增加细胞能量供应。
［关键词］厚朴；SD大鼠；心肌缺血/再灌注损伤；保护作用
厚朴为木兰科、木兰属植物，主产于四川、湖北等地，是我国特有的珍贵树种，其树皮是传统中药材，系国家计划管理的四种中药药材之一［1］。其味苦、辛，性温，归脾、胃、肺、大肠经［2］，具有行气化湿、温中止痛、降逆平喘之功效，用于湿滞伤中、脘痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳［3］。现代药理试验已证实厚朴的主要药理活性集中于厚朴酚及和厚朴酚上，其具有广谱抗菌、镇痛抗炎、抗肿瘤、抗氧化、保护心脑血管等作用。然而，有关其在心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）方面的药理作用研究鲜有文献报道，本研究通过复制心肌缺血/再灌注损伤大鼠模型，观察厚朴抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤的作用及可能的机制，为新药的开发研制提供参考。
1　仪器与方法
1.1　仪器
1.1.1　实验动物
健康SD雄性大鼠26只，体重为200～300 g。
1.1.2　主要试剂与仪器
1.1.2.1　试剂　厚朴注射剂，肌酸激酶（creatine kinase，CK）试剂盒、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。
1.1.2.2　仪器　电子天平、匀浆机、低速离心机、恒温水浴箱、722 s可见分光光度计。
1.2　方法
1.2.1　分组及给药
将大鼠随机分为三组：假手术组（n=7）、模型组（n=10）、药物组（n=9）。药物组腹腔注射厚朴10-7g/kg，模型组腹腔注射生理盐水1 ml/kg，连续预处理2 d，1次/d。
1.2.2　大鼠心肌MIRI模型的建立
末次给药后1 h，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，气管插管，接人工呼吸机和心电监护仪。仰位固定大鼠，手术部位剪毛，常规消毒皮肤，在左胸第3～5肋处将皮肤切开，见肋骨后，沿第4、5肋间剪开肌肉，暴露心脏。待呼吸、血压平稳15 min后，在左心耳与肺动脉圆锥之间，以左冠状动脉主干为标志，用医用缝合针穿刺结扎冠状动脉左前降支。当大鼠心电图T波出现高耸或倒置时则证明模型制备成功。缺血30 min后剪开缝合线再灌注120 min。假手术组与上述操作过程相同，只是穿线但不结扎冠状动脉左前降支。
1.2.3　观察指标及检测方法
1.2.3.1　血浆CK、MPO含量的检测　每组随机取6只成功造模的大鼠，颈总动脉取血，以3000 r/min离心10 min，分离出血浆，根据试剂盒说明书的操作方法测定大鼠血浆中CK、MPO含量。计算公式如下：CK活力 （U/ml）=［7.4491×（测定OD值-对照OD值）-0.0716］×样本测试前稀释倍数；MPO活力（U/L）=（测定OD值-对照OD值）/［11.3×取样量（L）］。
1.2.3.2　心肌中SOD活力的检测　将已取血的大鼠胸腔剪开，取出心脏，用PBS液充分洗净，滤纸吸干，于近心尖处剪下心肌组织，用电子天平称其质量，置于离心管中，按质量体积比1∶9加入生理盐水，用匀浆机制备成10%的匀浆液，2500 r/min离心10 min，取上清液，根据试剂盒说明书的操作方法测定大鼠心肌中SOD活力。计算公式如下：总SOD活力（U/mgprot）测样本蛋白浓度（mgprot/ml）。
1.3　统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　厚朴对MIRI大鼠血浆中CK、MPO含量的影响
模型组较假手术组CK活力下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），而给予厚朴可明显降低CK活力，药物组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。MPO活力，模型组较假手术组显著上升（P＜0.05），而给予厚朴后则显著降低，药物组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。
表1　厚朴对MIRI大鼠血浆中CK、MPO含量的影响（±s）

 
与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05
2.2　厚朴对MIRI大鼠心肌中SOD活力的影响
模型组心肌组织中的 SOD活力为 （116.53± 15.89）U/mgprot，低于假手术组的（132.67±18.95）U/mgprot（P＜0.05），而药物组的SOD活力（174.37±15.63）U/mgprot明显高于模型组（P＜0.05），表明厚朴能显著提升SOD活力。
3　讨论
MIRI是指在短时间心肌供血中断、一定时间内恢复供血，原缺血心肌组织的功能不但没有恢复，反而发生较供血恢复前更严重的损伤［4］。引起心肌缺血/再灌注损伤的主要机制为心肌细胞内钙超载、氧自由基损伤和心肌能量代谢障碍等［5］。
CK是存在于心肌细胞内的蛋白酶，与细胞内的能量转运、肌肉收缩和三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）再生有关，能可逆催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。发生心肌缺血/再灌注损伤后，由于心脏缺血缺氧、心肌细胞膜的损伤，心肌细胞发生能量供应障碍，细胞膜通透性增高，膜泵功能失调，细胞丧失调节胞内Ca2+水平的能力，变性或坏死，细胞内CK等酶漏出，致使血清中浓度升高［6］。同时无氧糖酵解使细胞内产生大量乳酸，发生酸中毒，抑制糖酵解途径，ATP生成进一步减少，心肌供能不足加重。由于缺血期已严重损伤了线粒体的功能，再灌注后，线粒体不能通过有氧氧化产生ATP，仍然通过糖酵解途径获得能量，故心肌功能仍不可恢复［7］。因此，通过检测血浆中CK活力的变化可判断心肌受损程度。本次试验采用CK这一指标观察到模型组较假手术组CK活力下降，但差异无统计学意义，存在偶然因素，可能与CK较易受标本储存温度和时间的影响有关。
MPO是白细胞和单核细胞内嗜天青颗粒产生的一种重要的过氧化物酶。当中性粒细胞受氧化应激等激活时，通过脱颗粒作用，MPO被释放至胞外或吞噬小体内，催化H2O2生成活性氧分子，参与炎症反应，降低细胞膜通透性，进而损伤心肌细胞［8-9］。MPO活力可反映中性粒细胞的浸润程度，以此间接反映心肌细胞的受损情况。本次研究发现，模型组MPO活力较假手术组显著上升，表明在MIRI过程中，中性粒细胞及其所介导的炎症反应起重要作用。
心肌缺血/再灌注使自由基的生成和清除失衡，导致氧自由基堆积，生物膜发生脂质过氧化反应，细胞膜的结构和功能损伤，从而加剧缺血心肌的组织损伤及功能障碍［10］。SOD是氧自由基（oxygen free radical，OFR）清除酶系统成员之一，可以特异性地催化氧自由基发生歧化反应，清除对体内有毒性作用的自由基，使其产生和清除处于动态平衡中，任何增强氧化作用和降低抗氧化作用的因素均可破坏这一平衡，导致一系列的病理生理异常，而检测SOD的活力可间接反映机体清除OFR和抗氧化损伤的能力［11-12］。本次试验发现，模型组与假手术组相比，心肌组织中SOD活力下降，说明OFR的堆积在一定程度上促进了MIRI的发生发展，使心肌细胞的损伤进一步加重。
厚朴为一种古老且应用广泛的药材，传统中医用其主治湿阻脾胃，气滞痞满，而随着现代医学的发展，越来越多的药理作用被发现，其中之一为对缺血/再灌注损伤的保护作用。本次实验证明，厚朴可提升SOD的活力，通过抑制OFR生成系统对心肌的脂质过氧化作用，减少脂质过氧化产物的生成。OFR的减少，对白细胞的激活作用减弱，因此抑制了中性粒细胞呼吸爆发，MPO的活力显著降低，这与厚朴的抗炎作用相关。厚朴可减少OFR的生成，减轻对线粒体的损伤，增加细胞能量供应，降低细胞膜的通透性，因此抑制了CK从细胞中的释放，降低了血浆中CK活力，从而可改善心肌细胞的损伤。综上所述，厚朴在保护心肌组织、抗MIRI上具有一定的作用。
厚朴为多年生落叶乔木，生长周期长，分布地区广，栽培简便，厚朴叶资源量大且每年可以再生，其主要药理成分厚朴酚、和厚朴酚具有多靶点、多环节、多效应等作用特点，毒副作用小，具有很大的研究和开发价值［13-14］。目前仍有大量厚朴活性成分值得深入研究，不明确的药理作用值得进一步阐明［15］，并且亟需针对厚朴的不足对其进行结构修饰、质量优化，以减少副作用。如通过临床试验，证明厚朴对于MIRI患者同样具有良好的疗效，可增加治疗MIRI的用药选择机会，指导后续的新药研究；还可拓宽其临床应用范围，普及老药新用的观念，以期发现更多中草药的临床新用途，促进中药在西医中的应用，推动中西医结合，将祖国医学发扬光大。
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Protective effects of Mangholia officinalis on myocardial ischemia-rePerfusion injury in rats
HU Yue
The Kingmed College of Laboratory Medicine，Guangzhou Medical University，Guangzhou　511436，China
［Abstract］Objective To investigate the effect and underlying mechanisms of Mangholia officinalis on myocardial ischemia-reperfusion injury　（MIRI）in rats.Methods Twenty-six healthy male SD rats were randomly divided into three groups：sham operation group（n=7），MIRI model group（n=10），drug group（n=9）.MIRI rat models were created by reperfusion for 120 min after ligaturing anterior interventricular branch of the left coronary artery for 30 min.Then the plasma and cardiac muscle tissue of six rats of each group were collected separately，and the activities of creatine kinase（CK）and myeloperoxidase（MPO）in plasma，superoxide dismutase（SOD）in myocardium were determined.Results Compared with sham operation group，the activity of CK of model group was decreased　（P＞0.05），the activity of MPO was increased obviously（P＜0.05），while the activity of SOD was decreased（P＜0.05）.Compared with model group，the activity of CK and MPO of drug group was decreased　（P＜0.05），while the activity of SOD was increased obviously（P＜0.05）.Conclusion Mangholia officinalis has a protective effct on MIRI in rats.Its mechanism is probably associated with resisting oxidation damage，reducing inflammatory reaction and increasing the supply of energy.
［Key words］Mangholia officinalis；SD rat；Myocardial ischemia-reperfusion injury；Protective effect
［中图分类号］R969
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）05（c）-0103-03
［科研项目］广州医科大学大学生课外科研项目（2013E004）
（收稿日期：2016-03-24本文编辑：方菊花）