单抗体夹心ELISA定量检测人神经生长因子试剂盒的研制
徐春娥1 王 威2 丁 锐2 纪 宏2 吴小红3 田 光3▲
1.北京市药品审评中心，北京 100053；2.北京市药品检验所，北京 100061；3.军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071
1.北京市药品审评中心，北京 100053；2.北京市药品检验所，北京 100061；3.军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071
［摘要］目的制备抗人神经生长因子（hNGF）单克隆抗体，并开发一种检测hNGF含量的ELISA试剂盒。 方法以重组人神经生长因子抗原与弗氏完全佐剂混合免疫BALB/c小鼠，并采用杂交瘤技术制备抗hNGF的单克隆抗体，然后建立快速检测hNGF含量的ELISA检测试剂盒。结果获得1株可分泌抗hNGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株。建立1种检测hNGF含量的ELISA试剂盒，该检测方法的回收率为85%～105%，灵敏度为0.63 ng/ml，变异系数＜10%，且特异性良好。 结论成功制备了抗hNGF的单克隆抗体，并建立了一种可快速检测hNGF含量的ELISA试剂盒。
［关键词］人神经生长因子；单克隆抗体；ELISA定量检测
神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是由其效应神经元支配的靶组织合成和分泌的一种对神经细胞生长发育、分化、新陈代谢等方面具有重要调控作用的活性多肽［1-5］，影响外周和中枢神经系统某些神经元的存活和分化，在神经系统的发育以及损伤和修复中具有重要作用［6-10］。多项研究［11-14］成果表明，神经生长因子具有广泛的临床应用前景。
目前，定量检测人神经生长因子的方法有R&D公司的ELISA试剂盒，该试剂盒通过酶联免疫反应对样品中的NGF进行定量，但是，R&D试剂盒是以昆虫细胞表达的重组人神经生长因子为标准品，其以包被抗体包被酶联板，加入抗原后以生物素化的检测抗体结合所捕获的抗原，然后再加入链亲和素-HRP结合物反应，洗涤后显色。由于该试剂盒在双抗体夹心ELISA的基础上采用了生物素-链亲和素放大系统，虽然敏感度高，但操作繁琐，检测过程耗时长，一个实验过程需要6 h完成，而且其标准曲线范围为31.25～2000.00 pg/ml，因此检测高浓度样品时需要高倍稀释，这导致检测结果误差很大。
因此，亟需开发一种快速简便、灵敏度适中且特异性强的hNGF快速检测试剂盒来解决现有试剂盒存在的问题，以推动有关人神经生长因子的研究、药品的开发及临床应用［15-21］。本研究开发了仅基于一株小鼠单克隆抗体的夹心ELISA试剂盒，可以完全满足以上要求。
1 材料与方法
1.1 材料
重组人NGF制品和rhNGF蛋白标准品由北京华安科创生物技术有限公司提供，为精确定量的rhNGF纯品；mNGF标准品（苏肽生，舒泰神药业有限公司）为市售产品；BALB/c小鼠由北京大学医学部实验动物中心提供；可拆卸式96孔板、浓缩洗涤液（20×）、终止液、封板膜、自封袋均为常规实验室耗材，试剂级别为分析纯即可；微量移液器、漩涡混匀器、电热恒温培养箱、超微量微孔板分光光度计均为市售实验室常规检测仪器。
1.2 抗hNGF单克隆抗体的制备
1.2.1 BALB/c小鼠免疫 选取5只雌性BALB/c小鼠，将重组人神经生长因子抗原与弗氏完全佐剂混合，乳化完全后皮下注射，每只小鼠的免疫剂量为80 μg。首次免疫后，间隔2周及3周，将rhNGF抗原与弗式不完全佐剂进行乳化后重复免疫2次，小鼠尾部取血，测血清效价，选取效价高的小鼠进行融合试验。融合前3 d，腹腔加强免疫1次。
1.2.2 细胞融合及杂交瘤细胞筛选 超净台内无菌环境下取免疫BALB/c小鼠的脾脏研磨制成脾细胞悬液，用RPMI 1640培养基洗涤2次，收取1×108脾细胞与2×107～5×107骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支50 ml融合管中，补加RPMI 1640培养基至30 ml，充分混匀。1000 r/min离心10 min，将上清尽量吸净。在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀。用1 ml吸管在1min左右加预热至37℃的50%PEG 2000（pH= 8.0）1 ml，边加边轻轻转动，肉眼可见有颗粒出现，缓慢加入RPMI 1640培养基至20 ml。1000 r/min离心6 min，弃去上清。前10 d在HAT选择性培养基中进行培养，之后直至第1次克隆化完成前选用HT培养基培养。2周后用间接酶联免疫吸附法（ELISA法）检测融合细胞的阳性率，选出阳性值较高的孔，经有限稀释对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，连续克隆化3次使阳性克隆孔的阳性率达2次100%后，选出阳性值高的孔转孔并扩大培养并冻存。
1.2.3 抗hNGF单克隆抗体腹水的制备及抗体纯化采用体内诱生法大量制备单克隆抗体。取6～8周龄的健康BALB/c雌性小鼠，腹腔注射石蜡（0.5 ml/只）。1周后，杂交瘤细胞离心洗涤，用PBS调整细胞数至1× 106个/ml，每只小鼠注射0.5 ml。5～7 d后，待小鼠腹部增大，采集腹水。腹水离心后收集上清，用HITRAP Protein A HP预装柱纯化抗体，分装后于-70℃保存。
1.3 抗hNGF单克隆抗体性质鉴定
1.3.1 抗hNGF单克隆抗体亚类鉴定 采用Rapid ELISA Mouse mAB Isotyping Kit鉴定单抗的类及亚类，按照试剂盒说明书操作。
1.3.2 抗hNGF单克隆抗体亲和力常数测定 采用捕获抗体的方法，用GE公司生物分子相互作用分析仪Biacore 3000检测抗hNGF单克隆抗体的亲和力及结合动力学。
1.3.3 抗hNGF单克隆抗体特异性鉴定 采用Western blot鉴定单克隆抗体的特异性，抗hNGF单克隆抗体蛋白的纯化效果用SDS-PAGE鉴定。对rhNGF和mNGF进行SDS-PAGE电泳，电转印后，用制备的单抗（1 μg/ml）进行孵育，AP标记的羊抗鼠IgG作为二抗（1∶5000稀释），按Western blot的一般步骤操作。
1.4 定量检测hNGF蛋白含量的酶联免疫试剂盒制备
试剂盒按常规方法开发并组装，方法简述如下。
1.4.1 酶标板包被 将抗hNGF单克隆抗体用50 mmol/L、pH=9.5的碳酸缓冲液稀释后加入酶标板的各孔，每孔100 μl，吸附过夜，用吐温-磷酸盐缓冲液洗板，再用吐温-磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被的酶标板。
1.4.2 酶标单克隆抗体制备 试剂盒中的酶标单克隆抗体可以用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗hNGF单克隆抗体来制备，制备方法如下：①以NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10 mg/ml。②在碱性碳酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH=9.5）中透析6 h，实现HRP对抗hNGF单克隆抗体的标记，反应结束后用新鲜配制的1 mg NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜。③用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗hNGF单克隆抗体。
1.4.3 辅助试剂 酶联免疫试剂盒中，辅助试剂包括酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液，用于试剂盒的辅助试剂如下。①底物显色溶液：50 mmol/L磷酸-枸橼酸缓冲液（pH=5.0）配制的3%过氧化氢溶液为底物溶液A，浓度为0.1 mg/ml的四甲基联苯胺（TMB）甲醇溶液为底物溶液B；②反应终止液：2 mol/L硫酸；③清洗缓冲液（20倍浓缩液，20×）：20 mmol/L PBS（pH=7.4）配制的0.05%吐温20溶液；④样本稀释液：2%小牛血清白蛋白（BSA）。
1.5 酶联免疫试剂盒检测hNGF蛋白含量的方法
检测hNGF蛋白含量的步骤简述如下。
1.5.1 制备标准曲线 ①抗原-抗体反应：在试剂盒提供的酶标板的微孔中分别加入25 μl不同浓度（0、7.8125、15.6250、31.2500、62.5000、125.0000 ng/ml）的rhNGF蛋白标准品，接着每孔加入75 μl酶标试剂混匀，37℃孵育30 min。重复洗板操作4次。②显色反应：每孔依次加入底物溶液A，显色液B各50 μl，显色10 min，每孔再加入50 μl反应终止液结束反应。③比色：将空白对照孔的吸光值调零，用酶标仪在450 nm双波长下测定OD值并记录。④使用直线线性拟和方式进行数据处理，以各标准品的OD450值为纵坐标（Y轴），各标准品的浓度为横坐标（X轴）作图，得到标准曲线。
1.5.2 样品检测 待测样品与标准品同时加样，检测步骤相同，检测样品的OD值减去空白对照的OD值之后，带入标准曲线方程中得到样品NGF浓度，整个检测可在1 h左右完成。
1.6 定量检测hNGF含量的酶联免疫检测试剂盒的评价
1.6.1 准确性 取一批已知浓度110 μg/ml的rhNGF蛋白溶液，在规定范围内根据测定结果进行评价。分别取稀释蛋白含量为10、50、100 ng/ml浓度的供试品溶液各1份，按ELISA检测试剂盒检测步骤进行6次独立试验。用由浓度为10、50、100 ng/ml的标准品所检测得到的吸光度回归标准曲线得到的值进行回收率比较。
1.6.2 精密度 随机抽取2块包被后的板，取一批已知浓度110 μg/ml的rhNGF蛋白溶液，在规定范围内根据测定结果进行评价。分别取稀释蛋白含量为10、50、100 ng/ml浓度的供试品溶液各1份，按ELISA检测试剂盒检测步骤进行6次独立试验。计算每次测定结果，求出均值（x）、标准差（s）和相对标准偏差（RSD）。
1.6.3 检测敏感度 根据上述实验操作结果计算本试剂盒的检测敏感度。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞株的建立
选取的5只小鼠经重组人神经生长因子连续3次免疫后，尾部取血测定每只小鼠血清效价。图1结果显示，5只免疫小鼠的血清效价有明显差异，其中2#小鼠的血清效价最高，选取其进行细胞融合试验。
.jpg)
图1 免疫的5只小鼠血清效价图
所选小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合处理后，采用间接ELISA法检测，选出阳性值较高的融合细胞；采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化，共获得13株杂交瘤细胞；采用体内诱生法大量制备单克隆抗体，将所得的13份纯化抗体进行筛选，最终获得高效稳定分泌抗hNGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株6G3可用于检测试剂盒的建立，并对其进行低温保藏。
2.2 单克隆抗体性质检定
经鉴定细胞株6G3的IgG亚类为IgG1型，轻链为κ。对所获得单克隆抗体的亲和力结合动力学进行分析，结果见表1。结合速率常数Ka值为1.41× 106/（M·s），提示抗体与抗原反应迅速；解离速率常数Kd值为2.48×10-4/s，提示抗原抗体复合物结合稳定；反应平衡常数为1.76×10-4M，提示结合反应进行完全。
表1 Biacore检测抗hNGF单克隆抗体与rhNGF抗原的亲和力
.jpg){kind=small}
将图2用Gel-Pro软件分析电泳条带的结果，经计算抗体纯度＞90%，能够满足实验要求。对rhNGF和mNGF进行SDS-PAGE电泳，电转印后，进行Western blot实验，结果见图3。
由于人的NGF与小鼠NGF之间同源性高达89.1%，并有资料证明人与小鼠NGF之间存在免疫交叉反应。由图3结果可见，在Western blot鉴定过程中也得到了相同的结果，Western blot检测结果显示与mNGF存在微弱交叉反应。
.jpg)
图2 抗hNGF单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE电泳图谱
.jpg)
图3 抗hNGF单克隆抗体的Western blot鉴定图谱
2.3 检测试剂盒的制备
根据实验，最终的检测条件是：样品稀释至标曲范围后加入25 μl/孔和酶标抗体75 μl/孔，37℃孵育30 min，洗板3～5次，显色剂A、B混合后100 μl/孔37℃避光显色5～10 min，加终止液50 μl/孔，450 nm波长下读取光吸收值。标准曲线绘制以标准品7.8125、15.6255、31.2500、62.5000、125.0000 ng/ml的浓度为横坐标，其对应的A450值为纵坐标，得到线性方程，其线性关系良好（r2=0.998）（图4），样品定量通过带入标准曲线方程计算得到。
.jpg)
图4 ELISA试剂盒检测重组人NGF的标准曲线图
2.4 检测试剂盒的验证
采用本试剂盒对3份样品进行检测，结果见表2。平均回收率为88.43%，在85%～105%之间；对10、50、100 ng/ml浓度的18次检测结果进行统计，x分别为 8.9252、44.2828、87.4650 ng/ml，s分别为 0.3980、2.4547和4.0366，RSD分别为4.46%、5.54%和4.62%，精密度结果显示RSD≤10%，检测灵敏度为0.63 ng/ml。综合以上数据，试剂盒在方法学验证方面表现为回收率略低（＜90%），但3个浓度范围检测结果的变异系数均较小（5%±0.5%），且回收率基本相同，鉴于本方法主要用于生产中间样品的定量检测，而非最终产品的放行检测，回收率在85%～105%之间完全可以接受，另有一点需要注意的是显色时间的控制非常重要，实际操作过程应严格按照方法参数执行。
表2 试剂盒评价检测数据表
.jpg)
3 讨论
NGF作为神经系统重要的多肽因子，可以促进损伤或病变神经元的再生，是目前用于治疗神经损伤非常有效的一种药物，对NGF制剂的研制具有巨大的经济效益和社会效益。近年来，随着基因工程技术的日益提高，NGF的获得途径也从最早的动物组织提取发展到现在的真核细胞重组表达，在满足日益增长的临床药物需求的同时，新技术的发展也带来了一些新的问题，即在细胞大规模培养进行NGF表达及后期纯化过程中，为满足生产过程中的质量控制，亟需一种快速、稳定、精确的定量方法来监控生产中NGF含量的变化。
ELISA法是高通量筛选和定量检测生物技术药物常用的一种方法，其利用抗原抗体特异结合进行检测，分析灵敏度高，检测速度快。针对NGF含量的检测目前已有商业化的ELISA检测试剂盒提供，但在实际应用中因其检测过程耗时长、标曲线性范围窄、存在数据反馈不及时、检测结果误差大等问题，并不能很好地解决所面临的问题。
本研究对ELISA检测方法进行了重新开发，使用重组人神经生长因子蛋白抗原对动物免疫，通过细胞融合和筛选获得阳性杂交瘤克隆，通过该杂交瘤细胞制备得一株抗人神经生长因子的单克隆抗体，该单克隆抗体特异性强、敏感性高，可以在免疫组化、ELISA等多种方法中使用。由于重组人NGF的活性形式为同源二聚体，相同的抗原表位至少有2个，利用单株抗体分别包被酶标板并制备酶标抗体，最终组装成夹心ELISA试剂盒，所建立的ELISA检测试剂盒能够很好地解决上述问题。
按照国家对药品检测方法的相关要求，新开发的检测方法需要对其进行系统的方法学验证，因此本研究对组装试剂盒进行了相关方法学验证，验证数据显示，采用该试剂盒对样品中的rhNGF进行定量检测，不仅操作简单，而且具有线性好、灵敏度高和特异性强的特点，能够快速准确地计算出待测样品中rhNGF的含量。在实际应用中，通过本试剂盒检测能够真实地反应出发酵液和rhNGF纯化样品中rhNGF的存在水平，尽管Western blot显示该抗体与mNGF存在部分交叉反应，但是制成试剂盒后进行检测，与mNGF没有交叉反应。本试剂盒的建立为NGF大规模生产的质量控制提供了有力支持，能够为推动rhNGF的临床研究做出相应贡献。
［参考文献］
［1］Chaves RN，Alves AM，Lima LF，et al.Role of nerve growth factor （NGF）and its receptors in folliculogenesis［J］.Zygote，2012，21（2）：187-197.
［2］Yang SR，Li W，Lu YQ，et al.Effects of GM-CSF，IL-3，and GM-CSF/IL-3 fusion protein on apoptosis of human myeloid leukemia cell line TF-1 induced by irradiation［J］. Acta Pharmacol Sin，2004，25（1）：68-75.
［3］He GQ，Guo J，Duan JC，et al.Expression of nerve growth factor precursor，nature nerve growth factor and their receptors during cerebral ischemia-reperfusion injury［J］.Neural Regen Res，2011，6（22）：1701-1708.
［4］Fan BS，Lou JY.Recombinant expression of human nerve growth factor beta in rabbit bone marrow mesenchymal stem cells［J］.Mol Biol Rep，2010，37（8）：4083-4090.
［5］Counts SE，Mufson EJ.The role of nerve growth factor receptors in cholinergic basal forebrain degeneration in prodromal Alzheimer disease［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2005，64（4）：263-272.
［6］Stefan MG，Karl Heinz S，Sten H，et al.Basal serum land reactivity of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor to standardized acute exercise in multiple sclerosis and controls［J］.J Neuroimmunol，2003，138（1-2）：99-105.
［7］Sadeu JC，Doedée AM，Neal MS，et al.Neurotrophins（BDNF and NGF）in follicular fluid of women with different infertility diagnoses［J］.Reprod Biomed Online，2011，24（2）：174-179.
［8］Noh H，Seo H.Age-dependent effects of valproic acid in Alzheimer′s disease（AD）mice are associated with nerve growth factor （NGF）regulation［J］.Neuroscience，2014，266：255-265.
［9］De Rosa R，Garcia AA，Braschi C，et al.Intranasal administration of nerve growth factor（NGF）rescues recognition memory deficits in AD11 anti-NGF transgenic mice［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102（10）：3811-3816.
［10］Di Fausto V，Fiore M，Tirassa P，et al.Eye drop NGF administration promotes the recovery of chemically injured cholinergic neurons of adult mouse forebrain［J］.Eur J Neurosci，2007，26（9）：2473-2480.
［11］李剑波，潘海桦，姜云水，等.人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗酶联免疫检测法的建立及其应用［J］.中国现代应用药学，2015，32（1）：10-14.
［12］孙亮，于志新，赵风强，等.蛋白酶K单抗研制及其双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立［J］.免疫学杂志，2015，31（2）：161-164.
［13］马健，倪超，王海鹰，等.幽门螺杆菌单克隆抗体的制备及其检测应用［J］.现代食品科技，2015，31（4）：228-233.
［14］杨芳，邢文革，于海英，等.抗-HCV酶联免疫吸附实验试剂的评价［J］.中国输血杂志，2009，22（5）：380-382.
［15］张晓丽，帅敏，张玲，等.影响酶联免疫吸附试验的检测结果的因素和操作时的注意事项［J］.中国医药指南，2011，9（10）：176-177.
［16］Luechi NW，Demas A，Narayanan J，et al.Real-time fluorescence loop mediated isothermal amplification for the diagnosis of malaria［J］.PLoS One，2010，5（10）：e13733.
［17］宫苗苗，曾妮，程朝飞，等.狂犬病病毒基质蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立［J］.中国人兽共患病学报，2013，29（1）：17-22.
［18］吴延功，徐天刚，王志亮，等.重组N蛋白抗原检测PRRSV抗体ELISA的研究Ⅰ.ELISA方法的初步建立及其标化［J］.中国兽医学报，2005，25（4）：339-342.
［19］Kerr P，Chart H，Finlay D，et al.Development of a monoclonal sandwich ELISA for the detection of animal and human Escherichia coli O157 strains［J］.J Appl Microbiol，2001，90（4）：543-549.
［20］张留圈，张霄，刘媛，等.利用基因工程抗体建立的新型双抗夹心ELISA法检测Cry1Ac毒素［J］.江苏农业学报，2014，30（3）：634-639.
［21］张改梅，贾红，侯绍华，等.检测牛IFN-γ双抗体夹心ELISA的建立及在牛结核病诊断上的初步应用［J］.畜牧兽医学报，2014，45（10）：1693-1698.
Development of kits of a single antibody sandwich ELISA for quantitative detection of human nerve growth factor
XU Chun-E1WANG Wei2DING Rui2JI Hong2WU Xiao-hong3TIAN Guang3▲
1.Beijing Center for Drug Evaluation，Beijing 100053，China；2.Beijing Institute for Drug Control，Beijing 100061，China；3.Institute of Microbiology and Epidemiology，Military Medical Science Academy of the PLA，Beijing 100071，China
1.Beijing Center for Drug Evaluation，Beijing 100053，China；2.Beijing Institute for Drug Control，Beijing 100061，China；3.Institute of Microbiology and Epidemiology，Military Medical Science Academy of the PLA，Beijing 100071，China
[Abstract]Objective To prepare mouse monoclonal antibody against human nerve growth factor（hNGF）and develop an ELISA kits for quantitative detection of hNGF.Methods BALB/c mice were immunized with recombinant human nerve growth factor antigen and Freund′s complete adjuvant，the monoclonal antibody against hNGF was prepared by the technique of hybridoma，and then the ELISA detection kit for rapid detection of hNGF content was established.Results 1 hybridoma cell line secreting monoclonal antibodies against hNGF was obtained.1 ELISA kits for the detection of hNGF content was established.The recovery rate of the detection method was 85%-105%，the sensitivity was 0.63 ng/ml，the coefficient of variation was less than 10%，and the peculiarity was good.Conclusion A monoclonal antibody against hNGF is successfully prepared，a rapid and precise ELISA kit is established for detection of rhNGF content.
[Key words]Human nerve growth factor；Monoclonal antibody；ELISA for quantitative detection
［中图分类号］R-331［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）05（c）-0008-05
▲通讯作者
（收稿日期：2016-04-11本文编辑：祁海文）