基于DNA条形码（ITS2）的中药材防风与其混伪品的鉴定
林　好1　钱洁颖2　李斯璐3　欧辉鸿1　夏海珊1，4　刘　镛1，4▲
1.广东医科大学药学院，广东东莞　523808；2.广西医科大学生物化学与分子生物学教研室，南宁　530021；3.广东医科大学基础医学院，广东东莞　523808；4.广东天然药物研究与开发重点实验室，广东湛江　524023
［摘要］目的通过ITS2序列分析，对防风及其易混伪品进行鉴定，确保用药安全。 方法从GenBank数据库下载中药材防风与其混伪品的DNA条形码ITS2序列，利用MEGA 6.06软件进行比对分析，计算GC含量及变异位点、种内、种间遗传距离，并构建NJ系统发育树，应用ITS2数据库网站预测其ITS2二级结构。　结果序列分析与遗传距离结果显示，防风与其混伪品存在明显差异，基于ITS2序列的NJ树及其ITS2二级结构均可以将防风与其混伪品进行区分。　结论ITS2能够准确鉴定防风及其易混伪品，可用于中药材的快速鉴别。
［关键词］防风曰DNA条形码曰混伪品曰ITS2曰分子鉴定
防风（Saposhnikovia divaricata）是双子叶植物伞　形科（Umbelliferae）多年生草本植物防风属（Saposhnikovia）防风的干燥根［1］，是常用的中药材之一，主要产于我国北部和东北部，分布于东北、华北及陕西、宁夏、甘肃、山东等地［2］。防风具有祛风解表、除湿止痛、疏肝解痉、杀虫止痒的功效，主治外感风寒，头痛项强，目眩昏涩，风寒湿痹，骨节酸痛，腹痛泄泻，肠风下血，破伤中风，麻疹难透，风疹瘙痒，疮疡初起。由于防风的药用价值高，市场需求极大。近年来，部分不法商人以川防风、杏叶防风、华中前胡、田葛缕子、硬阿魏、野萝卜等冒充正品防风，影响了用药疗效及安全。传统的防风鉴定方法主要是从基原、性状、显微、理化等方面进行区别［3-5］，这些方法对操作人员的专业知识要求较高，具有一定的局限性，难以满足中医药现代化发展的要求，因此，亟需建立一种简单、快速、准确的鉴定防风药材及其混伪品的方法。
DNA条形码［6］（DNA barcoding）技术是用一段标准的、较短的DNA序列作为物种标记的一种物种分子鉴定方法，可以对生物物种实现准确、快速、简便的鉴定。“DNA条形码”首先由加拿大动物学家、皇家学会会员Paul Hebert于2003年提出，是在分子分类学和DNA分类学的基础上用单一的小片段基因作为物种的条形码，进而为整个生物界的物种编码，达到类似超市利用商品条形码可以快速准确识别成千上万种商品的效果［7］。
随着分子生物学以及生物信息学的快速发展，应用DNA条形码技术对物种进行鉴定已逐渐成为中药材分类学的研究热点［8］，但是利用ITS2（internal transcribed spacer 2）对伞形科药用植物防风的鉴定研究尚未被发现。本实验利用ITS2序列对防风及其混伪品进行分子鉴定，旨在为防风的快速准确鉴定及其开发利用提供科学依据。
1　材料与方法
1.1　材料来源
本实验所用材料包括防风及其混伪品共7个物种16份样品，样品的ITS2系列通过GenBank数据库下载，并且经NCBI-Blast比对确认为正确序列，样品ITS2序列信息见表1。
表1　样品ITS2序列信息

1.2　数据分析
用MEGA6.06进行序列比对分析，用Schultz等的研究方法（http//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg. de/cgi-bin/index.pl）预测各物种ITS2的二级结构［9］，用MEGA6.06（molecularevolutionarygeneticsanalysis6.06）软件基于Kimura two-parameter（K2P）模型分析变异位点、遗传距离，用Neighbor-Joining（NJ）邻接法构建系统发育树，利用Bootstrap［10-11］法（1000次重复）检验各分枝的支持率。
2　结果
2.1　防风及其混伪品药材ITS2序列差异分析
序列分析结果显示，4份不同来源防风的ITS2序列长度均为214 bp，平均GC含量为56.1%，种内变异位点数量为0。防风与其混伪品的ITS2序列长度范围为175～226 bp，平均GC含量为57.3%。利用MEGA6.06进行多重序列比对后，防风及其混伪品的ITS2序列在多重比对后长度为238 bp，其中保守位点为71个，变异位点为167个，种间差异较明显，易于区别。其中基原物种野萝卜与防风的变异位点最多，其变异位点数为117个，而防风与华中前胡、川防风、田葛缕子、硬阿魏、杏叶防风的变异位点数分别为19、31、51、56、69个，因此基原物种野萝卜与防风的差别最大（表2）。
表2　防风及其混伪品的ITS2序列特征

2.2　防风及其混伪品种内和种间差异分析
利用MEGA6.06软件计算防风及其近缘属混伪品的种内遗传距离（intraspecific genetic distance）和种间遗传距离（interspecific genetic distance），可以得到基于K2P模型的遗传距离，具体见表3。经分析表明，防风的ITS2序列无变异，种内遗传距离为0，平均种内遗传距离为0。防风与其混伪品的种间最小遗传距离为0.0260，最大遗传距离为0.6000，平均遗传距离为0.1850。防风与同属伞形科近缘物种川防风与华中前胡间的最小遗传距离均为0.0260，大于防风种内最大遗传距离。防风与其他混伪品的种间最小遗传距离明显大于防风的种内最大遗传距离，提示K2P距离可以鉴别防风及其常见混伪品。
表3　防风种内及其与混伪品种间的K2P距离（cm）

2.3　NJ树聚类分析
从基于ITS2序列构建的防风及其混伪品NJ系统聚类树（图1）中可以看出，NJ系统聚类树显示防风单独聚为一支，支持率为97%，表现出良好的单系性，并且可以看出非同属物种杏叶防风、华中前胡、田葛缕子、硬阿魏、野萝卜分别各聚为一支，与防风明显区分开。NJ树显示，防风与川防风之间的亲缘关系很近，支持率为94%，因此，NJ树可以直观地展现防风与其混伪品不同序列的物种鉴别情况，用ITS2条形码技术能够准确鉴别防风与其混伪品。

 
图1　基于ITS2序列构建的防风和其混伪品NJ树
2.4　防风与其混伪品ITS2序列的二级结构分析
由图2可知，防风及其混伪品的ITS2序列二级结构臂夹角几乎类同，但是臂环的大小、茎环数目以及环与环的距离均不同。防风与不同属物种野萝卜的二级结构图差别较大，从臂的夹角、臂环的大小、茎环数目等方面都可以快速准确地鉴定防风。防风与川防风亲缘关系较近，其二级结构臂夹角、臂环大小等比较类似，但防风的1臂长要比川防风1臂长明显长一些，且1臂长的茎环数目也有所不同。对于亲缘关系较近、种间变异较少的物种，ITS2序列二级结构虽然比较相似，但也可鉴别，因此，ITS2序列的二级结构作为DNA条形码辅助分析手段可为准确有效地鉴别中药材与其混伪品提供重要参考。

 
图2　防风及其混伪品药用植物ITS2序列的二级结构比较
3　讨论
DNA条形码技术在物种鉴定以及相关领域的应用研究已成为现代生物学最活跃的研究领域和新的热点问题之一，也是未来物种鉴定的发展趋势［12-13］。基于核酸序列分析的DNA条形码鉴定技术是一种新的分子鉴定技术，与传统的物种鉴定方法和基于PCR或基于分子杂交的DNA分子鉴定技术相比，具有准确性高 （DNA序列信息可以避免形态变异或趋同导致的物种鉴定误差）、效率高（通过建立数据库，可一次性快速鉴定大量标本）［14］、不受被鉴定对象的环境及个体发育和人为因素影响（物种的身份是通过实验技术来鉴定的，不受专家个人因素的影响）等优点［15］。对广大近缘物种进行DNA条形码鉴定，从而实现专有的“分子身份证”，这对植物种质资源保护、鉴定及开发利用具有重大的科学意义［16-17］。
随着社会的不断进步和科技的高度发展，人们对中药材的重视程度与日俱增，药材使用的安全性与准确性也引起人们的高度重视。陈士林等［18］提出将DNA条形码技术用于中药材的鉴定，建立了药用植物DNA条形码鉴定策略及关键技术分析，并于2010年首次提出核基因片段ITS2可作为药用植物标准DNA条形码，其发现ITS2序列在6600份药用植物样本中的扩增效率达93.8%，物种水平鉴定成功率高达92.7%，随后在此基础上建立了以ITS2为为核心、psbAtrnH为辅的中药材DNA条形码鉴定体系和分子鉴定指导原则，为DNA条形码技术在中药材鉴定领域的应用和发展提供了扎实的数据基础和切实可行的方法学指导。基于ITS2的DNA条形码技术为中药材的快速准确鉴定提供了诱人的前景，受到越来越多的学者关注［8，19-20］。作为DNA条形码序列，其中的一个必要条件是种间差异比较大，便于区分，而种内差异比较小，从而使种间与种内变异有差异，并且不存在重叠区［18］。本研究通过ITS2序列分析防风与其混伪品的种间最小遗传距离和防风的种内最大遗传距离，结果显示其种间差异明显大于种内差异，并且无重叠区，提示ITS2序列作为DNA条形码序列鉴定防风与其混伪品是可行的。构建的系统发育树，除来源不同的川防风的支持率稍低外，其他各枝支持率均＞80%，提示系统发育树的可靠性较大，而且通过系统发育树，可以很清晰地分辨出防风与其混伪品。
中药材防风在临床上的应用十分广泛，但是其品种混杂，必须建立一种快速准确的鉴定方法。本研究基于ITS2条形码序列研究防风与其近缘物种及易混品的种内、种间遗传距离，构建NJ树以及ITS2序列的二级结构，能够准确区分防风及其易混品，因此，作为DNA条形码的ITS2序列为准确、简便地鉴定防风及其混伪品提供了新的分子鉴定方法，为控制药材质量稳定和指导临床合理用药提供了科学依据。
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Identification of Saposhnikovia divaricata and its adulterants based on DNA barcode(ITS2)
LIN Hao1　QIAN Jie-ying2　LI Si-lu3　OU Hui-hong1　XIA Hai-shan1，4　LIU Yong1，4▲
1.School of Pharmac，Guangdong Medical University，Dongguan　523808，China；2.Department of Biochemistry and Molecular Biology，Guangxi Medical University，Nanning　530021，China；3.School of Basic Medicine，Guangdong Medical University，Dongguan　523808，China；4.Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs，Zhanjiang　524023，China
[Abstract]Objective To identify Saposhnikovia divaricata and its adulterants by using ITS2 sequence analysis and to secure medication safety.Methods ITS2 sequences of Saposhnikovia divaricata and its adulterants were downloaded from GenBank，MEGA 6.06 software was used for sequence analysis to summarize GC content，variation sites，estimate intra-and inter-specific genetic distances，and built NJ trees.Moreover，the secondary structure of ITS2 was predicted by using the ITS2 database websites.Results ITS2 sequence analysis and genetic distances calculation showed significant difference in the samples.Further more，NJ tree and secondary structure results could distinctly differentiate quality product and adulterants.Conclusion ITS2 can effectively identify Saposhnikovia divaricata and its adulterants，as a result，it can be used for rapid identification of Chinese medicinal materials.
[Key words]Saposhnikovia divaricata；DNA barcoding；Adulterants；Internal transcribed spacer 2；Molecular identification
［中图分类号］R927
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）05（c）-0004-04
［基金项目］广东省中医药局科研项目（20151264，20161139）；广东省教育厅青年创新人才项目（2014KQNCX100）；广东医科大学国家级大学生创新创业训练计划项目（201510571 020）；广东医科大学省级大学生创新创业训练计划项目（201510571046，201510571079）；广东医学院科研基金项目（M2015015）；广东医学院大学生创新创业训练计划项目（XJ105711528，XJ105711443，XJ105711449，XJ105711453）；广东医学院大学生创新实验项目（2015ZZDM004）
［作者简介］林好（1992-），男，2012级在读本科生，主要从事中药分子鉴定工作
▲通讯作者：刘镛，男，硕士，讲师，主要从事药用植物分子生物学及分子药理学研究
（收稿日期：2016-03-16本文编辑：祁海文）