高效液相非接触电导法测定盐酸二甲双胍
肖　羽1，2　尹玮璐1　陈安丽1，2　陈缵光2
1.广州市药品检验所，广州　510160；2.中山大学药学院，广州　510006
［摘要］目的建立高效液相非接触电导检测法测定盐酸二甲双胍片中盐酸二甲双胍含量的新方法。方法色谱系统采用Uc1eosi1 C18柱（4.6×250 mm）；流动相：磷酸二氢铵溶液（称取磷酸二氢铵17 g，加水1000 m1溶解，用磷酸调节pH至3.0）；流速：1.0 m1/min；进样量：10 μ1；柱温：35℃。用非接触电导检测器对盐酸二甲双胍进行检测。　结果盐酸二甲双胍进样量在0.10～1.04 μg范围内与峰面积响应值呈良好线性关系（r=0.9960），平均回收率（n=9）为101.0%；RSD为0.26%（n=6）。　结论该方法简便、灵敏、重复性好，适用于盐酸二甲双胍的含量测定，结果满意。
［关键词］高效液相；非接触电导检测；盐酸二甲双胍；含量测定
盐酸二甲双胍片为降糖药，是治疗成人单纯饮食控制及体育锻炼治疗无效的2型糖尿病的首选药，特别是肥胖2型糖尿病。盐酸二甲双胍除可降低血糖外，还具有降低三酰甘油、胆固醇、极低密度脂蛋白，增加纤维蛋白溶解的作用，可预防及减少糖尿病的并发症，利于糖尿病的长期治疗，其通过增加胰岛素受体的结合力，抑制肝糖原异生和胃肠道对葡萄糖的吸收，从而降低血浆高血糖素水平，水溶性好，致乳酸中毒发生率低，不易在体内蓄积，对正常人无降血糖作用，属于国家基本药物，是目前被广泛应用的双胍类降糖药［1-3］。
中国药典和进口药品注册标准均采用紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法测定盐酸二甲双胍的含量［4-5］。其他文献报道的盐酸二甲双胍含量的测定方法包括高效液相色谱法［6-7］、分光光度法［8-9］、电化学法［10-11］和毛细管电泳法［12-13］。
在弱酸条件下，盐酸二甲双胍因质子化而带正电［14］。本文首次采用高效液相非接触电导检测法［15-16］，将非接触电导检测器的检测盒与高效液相色谱导液管连接，测定盐酸二甲双胍片中盐酸二甲双胍的含量，该法高效、快速、灵敏、专属性强、重复性好，可为盐酸二甲双胍含量的快速检测提供参考。
1　仪器与试剂
1.1　仪器
Agi1ent 1200型高效液相色谱系统（四元梯度泵、自动进样器、紫外可见波长检测器、化学工作站，美国安捷伦公司）；高压电源［17］和非接触电导检测器［18］（中山大学药学院研制）；色谱工作站，自制；数据记录处理在普通电脑上完成。
1.2　试剂
盐酸二甲双胍对照品（中检院，批号：100664-201103）；盐酸二甲双胍片（澳大利亚艾华大药厂，批号：8030050、8030051、8030053）；其他试剂为国产分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
2　方法与结果
2.1　色谱条件
色谱柱：Nuc1eosi1 C18柱（4.6×250 mm）；流动相：磷酸二氢铵溶液（称取磷酸二氢铵17 g，加水1000 m1溶解，用磷酸调节pH至3.0）；流速：1.0 m1/min；进样量：10 μ1；柱温：35℃。检测器：非接触电导检测器，激发频率为60 kHz，激发电压为60 VP-P。
2.2　溶液制备
2.2.1　对照品溶液的制备 取盐酸二甲双胍对照品，精密称取10.36 mg，置于50 m1的量瓶中，加流动相30 m1，超声处理30 s，加流动相至刻度，摇匀，精密量取5 m1于20 m1的量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得到对照品溶液。4℃下保存，使用时稀释至所需质量浓度。
2.2.2　供试品溶液的制备 取供试品20片，精密称定，求出平均片质量，研细后精密称取适量（约相当于盐酸二甲双胍50 mg），置于50 m1量瓶中，加流动相溶解后，滤过，精密量取续滤液5 m1于100 m1的量瓶中，稀释至刻度，摇匀即得供试品溶液。
2.2.3　空白溶液的制备 按处方比例制备不含盐酸二甲双胍的空白样品，按供试品溶液制备方法制成空白溶液。
2.3　系统适用性试验
吸取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各10 μ1，分别注入高效液相色谱仪，用非接触电导检测器检测，记录色谱图。在该试验条件下，供试品溶液和对照品溶液相同位置有吸收峰，空白对照色谱图在对照品峰位置无干扰峰（图1），证明辅料对测定无干扰。
图1　盐酸二甲双胍的高效液相非接触电导色谱图
1.盐酸二甲双胍A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.空白溶液
2.4　线性关系考察
精密吸取2、4、8、10、12、16、20 μ1对照品溶液（50 μg/m1），分别注入液相色谱仪，非接触电导检测器检测并记录色谱图，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，得线性回归方程：Y=678.79X+270.42 （r=0.996），表明盐酸二甲双胍进样量在0.10～1.04 μg的范围内与峰面积线性关系良好。
2.5　回收率试验
精密称取6份已知含量的盐酸二甲双胍样品（批号：8030050）适量（约相当于盐酸二甲双胍25 mg），分成3组，置50 m1量瓶，分别精密加入15、25、35 mg对照品，加流动相超声处理15 min，稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液取续滤液5.0 m1，置100 m1量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。量取10 μ1进样，记录峰面积并计算回收率（表1）。
表1　加样回收率试验结果（n=3）
2.6　精密度试验
精密量取盐酸二甲双胍对照品10 μ1，在上述色谱条件下，连续进样6次，记录峰面积，盐酸二甲双胍的峰面积RSD为0.20%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.7　稳定性考察
精密吸取盐酸二甲双胍对照品溶液，分别于0、2、4、8、12 h测定一次，重复5次，按上述色谱条件测定，记录峰面积。测定盐酸二甲双胍的峰面积基本无变化，计算盐酸二甲双胍的峰面积RSD为0.82%（n= 6），表明对照品溶液在12 h内稳定性良好。
2.8　重复性考察
取同一批号盐酸二甲双胍样品（批号：8030050），按供试品溶液的制备方法制备5份供试品溶液，分别取10 μ1注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。5份样品测定盐酸二甲双胍平均含量为101.3%，RSD为0.49%，表明此方法重现性较好。
2.9　样品测定
取3批盐酸二甲双胍片样品按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，取供试品溶液10 μ1，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图，测定样品中盐酸二甲双胍含量（表2）。
表2　样品测定结果（n=3）
3　讨论
3.1　检测器的选择
液相色谱仪的检测装置除了最常用的紫外检测器之外，还有二极管阵列检测器、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、化学荧光检测器、质谱检测器、电化学检测器、拉曼光谱检测器、磁共振检测器等。其中电化学检测器具有灵敏度高、选择性好、池体死体积较小、检测设备廉价、操作简便等诸多优势。传统的接触式电导检测器检测电极与缓冲溶液直接接触，易造成电极污染且难以清洗，非接触电导检测是近几年新发展起来的一种电导检测技术，其所用的检测池结构简单、使用方便，非接触电导可避免电极与待测溶液的直接接触，并彻底解决了接触电导检测中敏感电极污染、分离电压干扰测定等问题，实现检测电极与被测溶液之间的耦合，通过测定分析物的电导变化实现检测［19］。
3.2　流动相的选择
盐酸二甲双胍在水和甲醇溶液中保留时间较短，通过比较和选择，最终确定磷酸二氢铵溶液作为流动相。
3.3　流速及色谱柱的选择
流速对出峰时间有明显影响，流速越快则出峰越快。但随着流速增加，色谱柱压力也随之增加，柱压过高易导致色谱柱填料塌陷而损坏色谱柱。经试验，流速1.0 m1/min盐酸二甲双胍出峰时间较短，且色谱柱柱压不会太大。在本文试验条件下采用不同厂家或型号色谱柱进行试验，均能得到相似的色谱图，本法适用性良好。
3.4　结论
在本试验条件下，盐酸二甲双胍峰形较好，出峰快，分离效果好，辅料在选定的条件下不干扰测定，表明本法简便快捷、重复性好、专属性强、灵敏度高、取样量少、结果准确可靠，适用于盐酸二甲双胍的含量测定，为盐酸二甲双胍片质量标准的含量测定提供了参考。
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HPLC determination of metformin hydrochloride tablets with contactless conductivity detection
XIAO Yu1，2YIN Wei-lu1CHEN An-li1，2CHEN Zuan-guang2
1.Guangzhou Institute for Drug Contro1，Guangzhou　510160，China；2.Schoo1 of Pharmaceutica1 Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou　510006，China
［Abstract］Objective To estab1ish a new method for the rapid determination of metformin hydroch1oride in metformin hydroch1oride tab1ets by HPLC determination with contact1ess conductivity detection.Methods HPLC method was carried on a co1mn of Uc1eosi1 C18（4.6×250 mm）at co1umn temperature of 35℃，with the mobi1e phase of ammonium dihydrogen phosphate so1ution（ammonium dihydrogen phosphate so1ution 17 g with 1000 m1 water，adjusting pH to 3.5 with phosphoric acid），at f1ow rate of 1.0 m1/min，detection of metformin hydroch1oride by contact1ess conductivity detection. Results The 1inear range of metformin hydroch1oride was 0.10-1.04 μg（r=0.9960）and the average recovery rate was 101.9%with RSD 0.26%（n=6）.Conclusion The method is convenient，rapid and reproducib1e，and it can be used for rapid determination of metformin hydroch1oride with satisfactory resu1t.
［Key words］HPLC；Contact1ess conductivity detection；Metformin hydroch1oride；Content determination
［中图分类号］R927.2
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）05（a）-0008-03
（收稿日期：2015-12-25本文编辑：王红双）