锦灯笼宿萼提取物乙酸乙酯层改善东莨菪碱引起学习记忆损伤的研究
孙恺悦 尹 钰 姚苗苗
山西农业大学动物科技学院，山西晋中 030801
山西农业大学动物科技学院，山西晋中 030801
［摘要］目的研究锦灯笼宿萼提取物乙酸乙酯层（PEE）对东莨菪碱引起的学习记忆损伤的作用效果及其作用机制。方法将锦灯笼宿萼用95%乙醇浸提、溶剂分配，得到乙酸乙酯层。以不同剂量［10、30、100 mg/（kg·d）］的PEE连续灌服小鼠14 d，腹腔注射2 mg/kg东莨菪碱造模。用新奇物体实验检测其对学习记忆的影响；测定海马区乙酰胆碱酯酶（AChE）和超氧歧化酶（SOD）的活性以及丙二醛（MDA）的水平，研究其作用机制。结果新奇物体实验表明，10、30、100 mg/（kg·d）的PEE可以明显提高小鼠在新奇物体中的学习记忆能力；不同剂量的PEE可以抑制海马区AChE活性并增加SOD的活性，降低MDA的水平。毒性研究表明，PEE对小鼠体重及脏器系数均无明显影响。结论PEE通过抑制AChE活性及增加抗氧化应激水平改善由东莨菪碱造成的学习记忆损伤，提示其具有潜在预防或治疗阿尔茨海默病的效果。
［关键词］锦灯笼；乙酸乙酯层；学习记忆；乙酰胆碱；氧化应激
阿尔茨海默病（A1zheimer disease，AD）是一种神经退行性疾病，在85岁以上人群中发病率高达40%［1］。到目前为止，治疗AD最有效的药物是乙酰胆碱酯酶（acety1cho1inesterase，AChE）抑制剂，如多奈哌齐，他克林。这些抑制剂可以抑制AChE的活性，增加乙酰胆碱的量，减缓痴呆进程，因此被美国食品药品监督管理局批准用于中轻度AD的治疗［2］。但是现有用于治疗AD的AChE抑制剂存在一些问题，如肝毒性及有效治疗时间较短等［3］，因此，寻找更加新颖、治疗效果更好且副作用更低的胆碱酯酶抑制剂成为研究热点［4-5］。东莨菪碱是蕈毒碱型胆碱受体拮抗剂，可在小鼠及大鼠［6-7］甚至人体上产生可逆性的学习记忆损伤［8-9］，此种认知损伤在AD中常见。低剂量的东莨菪碱还可增加小鼠海马区的AChE活性［10］。东莨菪碱引起的学习记忆损伤动物模型已经被广泛用于活性物质抗AD的评价［10-13］。近期研究［10］表明，东莨菪碱引起的学习记忆损伤还与其增加脑内氧化应激水平相关。现有的广泛用于评价脑内氧化应激水平的标志物有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（ma1ondia1dehyde，MDA）等。
锦灯笼又名挂金灯、红姑娘，为茄科酸浆属，果实供食用，宿萼可泡茶饮用，其全株可入药。药典记载其具有“清热解毒，利咽化痰，利尿通淋。用于咽痛音哑，痰热咳嗽，小便不利，热淋涩痛；外治天疱疮，湿疹”。现代药理研究表明其具有抗炎、促凋亡、抗癌、抗疟、镇痛及抗虫感染等作用［14-20］。但到目前为止，锦灯笼对学习记忆影响的报道较少，有专利（专利号：BR201104177-A2）提到锦灯笼水层和醇层提取物具有促进神经再生的功能。本文用东莨菪碱造成学习记忆损伤模型，评价锦灯笼宿萼提取物乙酸乙酯层（PEE）对模型鼠学习记忆的影响，为锦灯笼的进一步开发利用奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
PEE由实验室制备：锦灯笼宿萼500 g粉碎，浸泡于5 L、95%乙醇中，震摇1周，过滤悬干，用水与乙酸乙酯（2∶1）进行溶剂分配，得到乙酸乙酯层30 g。东莨菪碱（阿拉丁试剂公司），纯度＞98%。AChE试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒（南京建城生物有限公司）、蛋白浓度测定试剂盒（日本Takara公司）。离心机（德国Eppendorf公司）、匀浆机（德国Qiagen公司）、酶标仪（美国Mo1ecu1ar Devices公司）、水浴锅（江苏金坛市金城国实验仪器）、万分之一电子分析天平（德国赛多利斯公司）、移液枪（德国Eppendorf公司）、超声清洗仪（宁波新兰芝生物科技股份有限公司）、中药粉碎机（上海淀久中药机械制造有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及给药 健康雄性ICR小鼠35只，购自山西医科大学动物实验中心，8周龄，体重（33±3）g。将其随机分成5组，每组7只：空白对照组、模型组、PEE 10 mg/kg组（PEE-L组）、PEE 30 mg/kg组（PEEM组）和PEE 100 mg/kg组（PEE-H组）。PEE溶解于2%乙醇的食用油中，连续给药14 d，此时空白对照组和模型组给予2%乙醇的食用油。用生理盐水溶解东莨菪碱，在行为学测试前30 min，模型组和药物组腹腔注射2 mg/kg的东莨菪碱，造成学习记忆损伤模型，空白对照组腹腔注射生理盐水。腹腔注射东莨菪碱30 min后，进行行为学测试。
1.2.2 动物行为学测试 新奇物体实验器具是一个长、宽、高分别为45、30、25 cm的长方形白色不透明塑料盒。实验前2 d使小鼠在其中每天适应5 min。正式实验由两部分组成——训练期和测试期：①在盒中放入两个相同的物体，这两个物体放在两个相邻的角落，距离盒壁5 cm。②将小鼠依次放入其中，使其自由探索5 min，作为训练阶段；60 min后，用一个新物体置换其中一个物体，然后依次放入小鼠，使其再次探索5 min，作为测试阶段。每只小鼠结束后，用70%乙醇擦拭整个盒体和其中的物体，避免小鼠留有异味影响下只小鼠的行为。小鼠鼻子距离物体2 cm以内并冲向物体，或用鼻子或前爪触碰到物体均视为探索行为，但小鼠蹲在物体上不算作探索行为。③得到小鼠总的探索时间和认知指数。认知指数=探索时间/探索总时间×100%。
1.2.3 小鼠处理 给药前对小鼠称重，给药期间每隔7 d进行一次称重。行为学测试后第2天，注射2 mg/kg东莨菪碱30 min后，快速将小鼠断颈处死，取出小鼠的心脏、肝脏、肾脏、脾脏和大脑并称重，从大脑中小心剥离出海马，然后存于-30℃冰箱中。脏器系数=脏器重量（g）/小鼠体重（g）×100%。
1.2.4 生化指标测定 从冰箱中取出海马，加入10倍体积的PBS，快速匀浆。将匀浆液在4℃、3500 r/min离心15 min，小心吸取上清液，分别进行AChE、SOD、MDA测定。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析，实验中所有数据均至少重复3次，采用单因素ANOVA进行分析，计量资料以均数±标准差（
±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。
±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1 PEE对小鼠新奇物体行为学测试的影响
与对照组比较，腹腔注射2 mg/kg东莨菪碱模型组在新奇物体辨别实验中认识指数明显下降（P＜0.01），表现出明显的学习记忆损伤，表明造模成功；在模型组基础上分别给予10、30、100 mg/kg的PEE后，学习记忆损伤均明显恢复（P＜0.05），各剂量组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组对物体探索总时间比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表1），说明东莨菪碱及化合物并未引起神经兴奋，使其探索时间延长，表明PEE可以改善模型鼠在新奇物体中的学习记忆能力，且不影响其活动量。
表1 PEE对小鼠新奇物体行为学测试的影响（±s）
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与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05
2.2 PEE对小鼠海马区AChE的影响
与对照组比较，模型组的AChE活性明显增加，增加了14.5%（P＜0.05）。与模型组比较，PEE-L组、PEE-M组、PEE-H组的 AChE活性分别下降了21.5%、11.4%、20.5%，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）（表2），表明PEE可降低由东莨菪碱引起的AChE的升高。
表2 PEE对小鼠海马区AChE的影响（±s）
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与对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，***P＜0.01
2.3 PEE对海马区氧化应激水平的影响
与对照组比较，模型组明显降低了海马区10.8% 的SOD活性（P＜0.05），且增加了7.8%MDA的量。PEE-M组、PEE-H组的SOD酶活性较模型组显著升高了14.5%、13.2%（P＜0.05），MDA的量显著降低了9.8%、20.1%（P＜0.05）；但PEE-L组仅使MDA的量显著降低了16.9%（P＜0.05），对SOD活性无明显影响（表3），表明PEE可增加小鼠海马的抗氧化应激的能力。
表3 PEE对海马区SOD及MDA的影响（±s）
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与对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
2.4 PEE对小鼠体重及脏器系数的影响
给药期间小鼠体重无明显变化，各组间小鼠体重比较差异无统计学意义（P＞0.05）（图1），表明PEE对小鼠体重无影响。各组间心脏、肝脏、肾脏和脾脏系数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表4），表明PEE对小鼠重要器官均无明显的毒性作用。实验结果初步说明短期口服PEE安全无毒。
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图1 小鼠体重变化图
表4 各组小鼠脏器系数的比较（±s）
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3 讨论
本文研究了PEE对东莨菪碱引起的学习记忆损伤的作用效果及机制。相关研究［10-13］表明，东莨菪碱可降低小鼠学习认知能力，因而大量文章利用此模型进行活性物质改善学习记忆能力的评价。本文结果显示，腹腔注射2 mg/kg的东莨菪碱可明显降低小鼠在新奇物体行为学实验中学习记忆能力，与之前研究数据相符，表明模型构造成功。而不同剂量的PEE对于模型鼠的学习记忆能力均有改善作用，但各剂量组之间对于学习认知的影响并无明显差异。
胆碱能缺失是AD发病的重要病因之一，东莨菪碱造成的模型鼠其AChE活性增高，造成乙酰胆碱含量下降［10-13］，所以首先调查了PEE对小鼠海马区AChE活性的影响。研究结果表明，不同剂量的PEE可降低AChE活性，从而提高小鼠的学习认知能力。
MDA为氧化应激的产物之一，其已作为轻度认知障碍及早期AD临床诊断的一项指标加以测定［21］。相关研究［22］发现，AD患者血液中的脂质过氧化物水平增高，总的抗氧化能力下降。脑是一个耗氧较多、清除自由基较少的器官，其中SOD是脑中清除自由基的重要酶。SOD基因表达和活性的改变与AD关系紧密［23］，因而进一步研究了PEE对SOD活性及MDA水平的影响。研究结果表明，东莨菪碱可降低海马区SOD活性，提高MDA的水平；给予不同剂量的PEE可以逆转此现象。
本文研究发现，不同剂量的PEE对SOD活性影响不同：低剂量的PEE对SOD活性无影响，但中剂量和高剂量的PEE可明显升高SOD活性，其可能是由于低剂量组尚未达到作用剂量。但在行为学方面，三个剂量的PEE对学习记忆影响并无显著性差异，可能是由于低剂量的PEE虽然对于SOD活性无明显提升，但对于降低MDA水平及抑制AChE活性均有明显作用，因而多重影响下，学习记忆也有显著提高。
老药新用因具有研发成功率高、副作用小、投资小等特点，成为近年来的研究热点。锦灯笼为我国传统药食同源性中药，现已将其作为治疗咽炎药物在市面销售，且效果良好。其提取物也被证实有多种功效［14-20］，但对于神经系统的影响研究较少。本文研究表明，PEE具有良好的改善学习记忆的能力，具有潜在治疗AD的作用。以锦灯笼作为研究对象，进行新功能的开发，可以增加其成药性。
本文研究表明，PEE可改善由东莨菪碱造成的学习记忆损伤，这一作用效果可能是通过抑制AChE的活性、增加脑内抗氧化应激水平达到的。本文提示PEE具有潜在预防或治疗AD的效果。
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The ethyl acetate layer of the Persistent calyx of the Physalis alkekengi L.var.franchetii attenuates scoPolamine-induced amnesia
SUN Kai-yue YIN Yu YAO Miao-miao
Co11ege of Anima1 Science and Veterinary Medicine Shanxi Agricu1tura1 University，Jinzhong 030801，China
Co11ege of Anima1 Science and Veterinary Medicine Shanxi Agricu1tura1 University，Jinzhong 030801，China
［Abstract］Objective To investigate the effects of PEE on scopo1amine-induced 1earning and memory impairments and the action of mechanisms.Methods The Physalis alkekengi L.var.franchetii was extracted with 95%aqueous ethano1，the extraction was purified between water and ethy1 acetate，and the ethy1 acetate 1ayer was used for the experiment.The mice were treated with PEE at doses of 10，30，100 mg/（kg·d）for 14 consecutive days，and then treated with scopo1amine at the dose of 2 mg/kg.The cognitive-improving effect of PEE on amnesic mice induced by scopo1amine was investigated by assessing the nove1 object recognition test.In order to confirm the under1ying mechanisms，activities of AChE and antioxidant enzymes were measured.Results Administration of PEE significant1y restored scopo1amine-induced memory impairments in the nove1 object recognition test.The increased AChE activities produced by scopo1amine were significant1y inhibited by PEE，the decreased SOD activities significant1y increased with a obvious reduction of MDA.In addition，there were no obvious difference about the body weight and organ index of mice.Conclusion These resu1ts indicate PEE restore the 1earning and memory deficiency induced by scopo1amine via inhibition of the AChE actitivies and increasing the antioxidant 1eve1，and it may be deve1oped for prevention or treatment of AD.
［Key words］Physalis alkekengi L.var.franchetii；Ethy1 acetate 1ayer；Learning and memory；Acety1cho1inesterase；Oxidative stress
［中图分类号］R285.5［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）05（a）-0004-05
［基金项目］山西农业大学引进人才科研启动项目（2014YJ04）
［作者简介］孙恺悦，女，博士，讲师，主要从事中药药理研究工作
（收稿日期：2015-12-16本文编辑：王红双）