类风湿性关节炎患者外周血中性粒细胞MMP-7、EMMPRIN表达及意义
李 威1 吴宝萍2
1.辽宁省本溪市中心医院急诊科，辽宁本溪 117000；2.煤炭总医院妇产科，北京 100028
［摘要］目的观察基质金属蛋白酶7（MMP_7）、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）蛋白及mRNA在类风湿关节炎（RA）患者外周血中性粒细胞中的表达，探讨其与RA相关性及意义。 方法采集2014年1月～2015年5月本溪市中心医院RA患者（RA组）及健康体检者（NC组）外周血中性粒细胞，采用Western b1ot及qRT_ PCR分别检测MMP_7及EMMPRIN在蛋白及mRNA水平表达，采用酶联免疫法检测血清炎性因子表达，并探讨其意义。结果RA组中MMP_7及EMMPRIN蛋白表达明显高于NC组（t=7.752，6.627，P＜0.01）。RA组中MMP_ 7 mRNA及EMMPRIN mRNA表达明显高于NC组（t=5.654，P＜0.01；t=3.531，P＜0.05）。Spearman相关性分析显示，外周血中性粒细胞MMP_7及EMMPRIN蛋白表达外周血与CRP、RF、PGE2、IL_8水平呈正相关 （P＜0.01或P＜0.05）。结论RA患者外周血MMP_7及EMMPRIN在蛋白及mRNA水平均升高，与RA发展具有正相关性。
［关键词］基质金属蛋白酶7；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子；类风湿关节炎
类风湿性关节炎（RA）是一种免疫性疾病，病情迁延不愈，具有较高的致残率［1］，可导致关节功能受损，降低生活质量［2］。在患者外周血中，多种细胞因子参与RA的发生及发展过程，并诱发患者发热及关节红肿等症状［3］。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）是一种跨膜蛋白，可诱导基质金属蛋白酶7（MMP_7）在中性粒细胞、单核细胞等向外周血释放，从而调节外周血中多种炎性因子水平，导致患者产生全身及局部症状［4］。本研究通过检测两者在RA患者中表达，旨在观察其与RA的相关性，探讨其意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2014年1月～2015年5月本溪市中心医院以美国风湿病学会2010年修订的类风湿诊断标准诊断的RA患者27例为研究对象（RA组），体检中心27例健康体检者为对照组（NC组）。其中男29例，女25例，年龄（55.64±23.08）岁，两组在年龄、性别方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，无伦理学争议。所有纳入研究患者无心、肺、肝脏、肾脏等重要器官疾病；无其他炎性关节病或伴有其他结缔组织病；无细菌及病毒感染；无肿瘤及血液病；未接受过抗风湿治疗。
1.2 实验材料
粒细胞分离提取试剂盒及Hanks液购自天津TBD公司；兔抗人MMP_7单克隆抗体、兔抗人EMMPRIN单克隆抗体购自美国Sigma公司；miRNA提取分离试剂盒、TRIzo1及 qPCR试剂盒购自美国GeneCopoeia公司；引物由大连宝生生物技术有限公司设计合成。
1.3 研究方法
1.3.1 外周血中性粒细胞的分离 取RA组及NC组患者外周抗凝静脉血各10 m1，Hanks液等倍稀释。按粒细胞分离提取试剂盒说明书进行中性粒细胞的分离及提取，调整细胞数为1×107进行实验。
1.3.2 Western blot 按说明书对中性粒细胞全蛋白进行提取，BCA试剂盒蛋白浓度定量，每条泳道上样量20 μg，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳转至PVDF膜，加入抗体，ECL发光，凝胶显像仪显像，分析灰度值。1.3.3 qRT-PCR法 按说明书分离纯化中性粒细胞RNA，浓度稀释为1.0 g/L，按反转录_扩增试剂盒说明书进行反转录扩增，反应结束分析溶解曲线。
1.3.4 血清炎性相关因子浓度测定 依照酶联免疫法试剂盒说明书测定所有患者静脉血样血清中CRP、RF、PGE2、IL_8的浓度。
1.4 统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（.jpg)
±s）表示，采用t检验，相关性分析采用Spearman分析法。以P＜0.05为差异有统计学意义。
±s）表示，采用t检验，相关性分析采用Spearman分析法。以P＜0.05为差异有统计学意义。2 结果
2.1 EMMPRIN、MMP-7在蛋白及mRNA中表达水平的比较
RA组中MMP_7蛋白表达明显高于NC组（t= 7.752，P＜0.01）；RA组中EMMPRIN蛋白表达明显高于NC组（t=6.627，P＜0.01）。RA组中MMP_7 mRNA表达明显高于NC组（t=5.654，P＜0.01），RA组中EMMPRIN mRNA表达明显高于NC组 （t=3.531，P＜0.05）（表1）。
表1 EMMPRIN、MMP-7在蛋白及mRNA中表达水平的比较（.jpg)
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2.2 RA患者炎性相关因子与MMP-7及EMMPRIN蛋白表达水平的相关性分析
外周血中性粒细胞MMP_7及EMMPRIN蛋白表达与外周血CRP、RF、PGE2、IL_8水平呈正相关（P＜0.01或P＜0.05）（表2）。
表2 RA患者炎性相关因子与MMP-7及EMMPRIN蛋白表达水平的相关性分析（.jpg)
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3 讨论
RA以滑膜增殖及骨质破坏为主要特征，常伴有全身症状，包括发热、无力、神经受累、心脏受累及肾脏受累等全身症状［5_6］。大量的基质金属蛋白酶（matrix meta11oproteinases，MMPs）在外周血及关节腔内的释放是RA发生、发展的主要原因之一［7］。MMPs代谢产物水平是RA病情活动度重要指标之一［8］。EMMPRIN是重要的MMPs上游调控因子之一，在转录水平调控MMPs的表达。赵元等［9］认为，EMMPRIN表达对MMP分泌具有刺激作用。另有研究［10_11］显示，中性粒细胞通过EMMPRIN促进RA患者滑膜MMPs表达和活化，增强成纤维细胞侵袭力，EMMPRIN拮抗剂可抑制这种促进作用，为RA关节骨和软骨损伤机制及治疗提供了重要的线索。RA患者滑膜组织中EMMPRIN mRNA表达明显高于正常滑膜组织，通过上调MMPs促进关节软骨破坏［12］。
本研究结果显示，在类风湿关节炎外周血中性粒细胞中MMP_7及EMMPRIN蛋白及mRNA表达水平明显高于NC组，说明MMP_7及EMMPRIN表达与RA具有相关性，EMMPRIN是免疫球蛋白超家族成员之一，是潜在的细胞表面粘附因子，对MMP_7释放具有调控作用，参与组织降解及重建，EMMPRIN对MMP_7的调控作用可能发生在转录水平［13］。有研究显示，EMMPRIN通过激活中性粒细胞TLR4受体促进MMP_7表达。本研究结果显示，外周血中性粒细胞MMP_7及EMMPRIN蛋白表达与血清炎性反应因子CRP、RF、PGE2、IL_8水平呈正相关，血清中CRP、RF、PGE2、IL_8是反映RA炎症程度及病情活动情况的重要指标［14］，提示EMMPRIN及MMP_7参与RA疾病活动过程，可能作为RA疾病严重程度及预后的预测指标。有研究［15］显示，RA患者外周血单个核细胞EMMPRIN蛋白及mRNA高于健康对照组，并与炎性因子及关节放射线分期具有正相关性。
本研究认为，MMP_7及EMMPRIN与RA发展具有正相关性。阻断EMMPRIN在转录水平的表达是否可以抑制RA中MMP_7释放，从而减少炎性因子表达，抑制全身反应，减轻骨和软骨组织破坏，改善患者生活质量，选择性抑制EMMPRIN的生物活性，可能是RA治疗的新途径，是进一步的研究目标。
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Expression and meaning of MMP_7，EMMPRIN protein and mRNA in peripheral polymorphonuclear leukocytes of rheumatoid arthritis patients
LI Wei1WU Bao-ping2
1.Department of Emergency，Benxi Centra1 Hospita1 in Liaoning Province，Benxi117000，China；2.Department of Obstetrics and Gyneco1ogy，Coa1 Genera1 Hospita1，Beijing 100028，China
1.Department of Emergency，Benxi Centra1 Hospita1 in Liaoning Province，Benxi117000，China；2.Department of Obstetrics and Gyneco1ogy，Coa1 Genera1 Hospita1，Beijing 100028，China
［Abstract］ObjectiveToobservetheexpressionofMMP_7，EMMPRIN proteinandmRNA inperiphera1 po1ymorphonuc1ear 1eukocytes of RA patients and to exp1ore the re1ationship and meaning with rheumatoid arthritis. Methods The periphera1 b1ood neutrophi1 was co11ected from RA patients（group RA）and hea1thy subjects（group NC）from January 2014 to May 2015 in Benxi Centra1 Hospita1.Western b1ot and qRT_PCR were respective1y used to tested the expression 1eve1 of MMP_7，EMMPRIN protein and mRNA.Enzyme 1inked immunosorbent assay was used to tested the expression of serum inf1ammatory cytokines and the meaning was exp1ored.Results The expression of MMP_7 and EMMPRIN protein in group RA was obvious higher than that of group NC respective1y（t=7.752，6.627，P＜0.01）.The expression of MMP_7 mRNA and EMMPRIN mRNA protein in group RA was obvious higher than that of group NC respective1y（t=5.654，P＜0.01；t=3.531，P＜0.05）.Spearman re1ated ana1ysis showed that MMP_7 and EMMPRIN protein in periphera1 po1ymorphonuc1ear 1eukocytes had statistica1 positive re1ationship with CRP，RF，PGE2 and IL_8 1eve1s（P＜0.01 or P＜0.05）.Conclusion A11 of MMP_7，EMMPRIN protein and mRNA 1eve1 in periphera1 po1ymorphonuc1ear 1eukocytes increase and has positive re1ationship with the progress of rheumatoid arthritis.
［Key words］MMP_7；EMMPRIN；Rheumatoid arthritis
［中图分类号］R593.22［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）04（c）-0046-03
［作者简介］李威（1982_），女，本科，主治医师，研究方向：风湿免疫疾病的临床及基础研究
（收稿日期：2016_02_08 本文编辑：王红双）