张　波1　刘　健2

1.贵阳市第一人民医院神经外科，贵阳　550002；2.贵州医科大学附属医院神经外科，贵阳　550004

［摘要］目的　探讨大鼠脑出血后不同时间水通道蛋白_4（AQP_4）、C_反应蛋白（CRP）及血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达及其与脑水肿的相关性。方法将90只大鼠分为对照组18只，实验组72只。其中对照组为假出血模型，实验组采用立体定向仪建立大鼠脑出血的模型，在脑出血后观察大鼠神经功能的变化。分别断头取脑，采用ELISA法检测血清CRP、VEGF，免疫组化方法检测脑组织AQP_4。结果实验组6 h到14 d足印迹试验评分高于对照组（P＜0.05或P＜0.01）。AQP_4、CRP和VEGF表达在6 h即升高，24 h、48 h、3 d、7 d明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。 结论脑出血后AQP_4、CRP、VEGF呈现过度表达，其动态变化与大鼠脑出血后神经功能反应、脑细胞水肿存在一定联系。推测三者参与了脑出血后脑水肿的形成与消退。

［关键词］脑出血；水通道蛋白-4；C-反应蛋白；血管内皮细胞生长因子；脑水肿

脑出血起病急骤、病情危险、残死率高，是急性脑血管病中最严重的疾病，为目前严重损害中老年人健康的疾病之一，并呈现出逐渐向青年人发展的趋势。而急性高血压性脑出血后继发的脑水肿和炎性反应是影响其预后、转归的关键因素。水通道蛋白_4（AQP_4）、C_反应蛋白（CRP）及血管内皮细胞生长因子（VEGF）与脑组织水肿密切相关。本研究通过检测大鼠脑出血后AQP_4、CRP及VEGF在机体内的表达，探讨大鼠脑出血后不同时间AQP_4、CRP及VEGF的表达及其与脑水肿的相关性。

1.1 实验动物

清洁、健康的Wistar大鼠90只，由贵阳医学院动物实验研究中心提供，合格证号：0201483，周龄为22周左右，体重（286.2±7.4）g。将大鼠分为实验组（脑出血，n=72）及对照组（假脑出血，n=18）。

1.2 主要药品与试剂

兔抗大鼠多克隆AQP_4抗体（北京博奥森生物技术有限公司），CRP试剂（美国R&D Systems公司分装），VEGF试剂（美国R&D Systems公司分装），免疫染色一抗稀释液（南京碧云天试剂公司），免疫染色二抗稀释液（南京碧云天试剂公司），水合氯醛（武汉市和昌化工有限公司）。

1.3 主要仪器与器械

68025 型鼠专用立体定位仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），LEICA RM2235切片机，LEICA HI1220摊片机，LEICA HI1210烤片机，LEICA ASP300脱水机，LEICA EG1150H包埋机，电热恒温培养箱，医用图像分析管理系统，O1ympus显微镜，NL1_9602酶标仪（北京恒奥德仪器仪表有限公司），微电钻，微量注射器。

1.4 方法

对照组予用灭菌空针按300 mg/kg抽取10%水合氯醛行腹腔内麻醉，麻醉生效后，将大鼠俯卧置于专用立体定位仪手术台上，固定头部，调节门齿托的高度，保持呼吸道通畅，使大鼠的前后囱处于同一水平。于右腹股沟区用理发器剪除毛发，常规消毒，切开约1 cm，钝性分离腹股沟区组织，找到股动脉，用肝素抗凝过的空针抽0.5 m1动脉血，并轻轻摇匀，防止血液凝固，备用。切口处1号线间断缝合，并再次消毒。用理发器剪除头顶部毛发后，常规消毒，在中线处作1 cm左右的直切口，分离皮肤及皮下组织，暴露前囟点，取前囟点右侧中线旁开3 mm、前1 mm，用自制微钻头钻孔，钻透颅骨至硬脑膜处，停止钻孔，骨孔大小约1.5 mm，用骨腊封闭骨孔后，缝合大鼠头皮，建立假脑出血模型。

实验组运用相同方法对大鼠麻醉、备皮、钻孔，用50 μ1微量注射器垂直从颅骨小孔进入，深度为颅骨下5.5 mm，缓慢注入自体血20 μ1，注射针停留2 min后，再缓慢注入自体血30 μ1，注射针再次停留10 min后，缓慢退出，缝合大鼠头皮，建立大鼠脑出血模型。术中及术后6 h内死亡的大鼠不记入本实验。

1.5 指标观察

1.5.1 行为学观察 手术过程中观察大鼠的呼吸、心率变化。待麻醉作用消失后，观察大鼠行动变化，如爬行步态、进食情况、翻正反射及对周围环境的反应，并采用足印迹试验评价其行为能力：用纸板折成等三边形的中空的三角体，其中长120 cm，周长90 cm。水平放置，底内面放置白纸。将四足沾有印油的大鼠从三角体一头放入，在另一头用食物引诱，使其从内通过。根据大鼠爬行的足印行神经学评分，其中足印较对称记1分；足印部分对称记2分；足印不对称记3分；足印一侧不明记4分；两侧足印不明记5分。分数越高，脑出血后症状越重，一般正常大鼠为1～2分。

1.5.2 解剖形态观察 实验组和对照组分别于术后6 h、24 h、48 h、3 d、7 d及14 d从大鼠的心脏取血。具体操作为：从前胸剪开胸壁，9号粗针头于左心室插入，针尖升至主动脉，用止血钳钳夹固定针头，剪开右心房。快速灌注生理盐水（常温）150～200 m1，待肝脏变白，血液颜色变清后，灌注4%多聚甲醛（4℃）400 m1左右。先快后慢，待肝脏和肢体变硬、苍白后停止灌注。立即处死，断头，解剖取脑，制作解剖切片。

1.5.3 CRP、VEGF的检测 采用双抗体夹心ELISA法，严格按说明书使用及操作，对实验组和对照组不同时期血清中的CRP、VEGF进行检测。

1.5.4 AQP-4免疫组化染色　①0.01 mo1/L的PBS漂洗液漂洗5 min×3次；②3倍于PBS漂洗液的过氧化氢液室温封闭10 min；③0.01 mo1/L PBS漂洗液漂洗5 min×3次；④血清封闭30 min，吸去多余血清；⑤加1∶300 AQP4兔抗大鼠多克隆抗体，于4℃过夜；⑥0.01 mo1/L PBS漂洗液漂洗5 min×3次；⑦加生物素化二抗，在37℃湿盒中孵育20 min；⑧0.01 mo1/L PBS漂洗液漂洗5 min×3次；⑨加SABC底物，在37℃湿盒中孵育20 min；⑩0.01 mo1/L PBS漂洗液漂洗5 min×4次；11○棕黄色DAB显色，苏木精复染，光镜控制，水洗复染，脱水及透明封片；12○每组取3张切片，随机选取6个不相同观察视野，应用Image_Pro P1us 6.0图像分析软件进行统计分析。

1.6 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用X2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 两组大鼠足印迹试验评分的比较

脑出血术后6 h，进行神经功能评价，实验组大鼠均不同程度表现出神志较差、饮食困难、对侧前肢小能伸直、同侧“划圈样”行走现象、左侧后肢收缩延退。足印迹试验显示，对照组与实验组术前足印基本对称，足印较一致；6 h组、24 h组足印不对称，出现一侧不明现象；48 h组、3 d组足印更不对称，足印间距不一致，出现一侧不明现象更加明显，可见双侧不明现象；7 d组、14 d组足印紊乱、不对称，足印间距不一致，出现一侧不明或双侧不明现象。足印迹试验评分显示，实验组从6 h组到14 d组其评分明显高于对照组，其中实验组3 d时评分最高（表1）。

表1　两组大鼠足印迹试验评分的比较（分，±s）

 

“*”代表与对照组比较；“_”代表无数据

2.2 实验动物大体解剖形态观察

模型成功后6 h，解剖大鼠脑组织进行大体形态学观察，见血肿边界清楚，形态较规则，呈椭圆形，有明显的占位效应。

2.3 两组大鼠血清CRP、VEGF含量测定的比较

与对照组比较，实验组不同时间段CRP、VEGF含量均出现升高，差异有统计学意义（P＜0.01）（表2）。

表2 两组大鼠血清CRP、VEGF含量测定的比较

 

“*”代表与对照组比较；“_”代表无数据

2.4 两组脑组织AQP-4表达水平的比较

实验组脑组织中AQP_4表达在24 h至第7天较对照组增多，差异统计学有意义（P＜0.01），6 h出现增多，第14天出现减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3　两组脑组织AQP-4表达水平的比较（±s）

 

“*”代表与对照组比较；“_”代表无数据

脑出血病情急、变化快、预后差，已成为全人类残疾和死亡的一个重要疾病［1］。其病理生理为血肿压迫周围组织，影响血液循环系统，进而激活纤溶酶原激活物、凝血酶等，引起脑组织炎性反应及血脑屏障破坏，导致血管源性脑水肿的形成，并在3～7 d内达到高峰。之后，血脑屏障破坏，炎性反应诱导神经细胞破坏及红细胞溶解，使红细胞内血红蛋白及其衍生物释放，引起细胞毒性脑水肿。再加上基质金属蛋白酶、白介素及其他损伤产物持续增加，维持细胞毒性及血管源水肿［2］，但以血管源性水肿为主［3］。另外，脑出血后直接导致中枢神经受损，使机体产生应激反应，激活机体内各种应激因子，可见诱发应激反应在脑出血继发性脑损伤中起着十分重要的作用，也是活体组织对损伤因子所产生的防御和应激反应［4］。目前，脑出血后脑缺血、炎性反应及脑水肿的研究已成为脑出血后病理损伤机制的研究热点。

AQP_4属于水特异性通道蛋白，在脑组织中含量最高，其能够发挥维持颅内水平衡的作用。AQP_4水平升高是反映脑水肿的重要标记［5］。在生理和病理状况下，脑组织中的AQP_4在调节中枢性渗透压、形成及消除脑水肿、维持体内液体平衡等方面具有重要作用［6］。本实验显示，血肿周围脑组织中AQP_4的表达在24 h内就出现升高，在3 d达到最高，这与目前认为的脑出血后脑水肿的时间及脑水肿的高峰期规律基本一致。脑出血患者24 h至第7天脑组织中AQP_4的表达与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。AQP_4促进IL_6和TNF_α等细胞因子的释放，促进肝脏分泌CRP，CRP的过度增加，加重炎性反应，又进一步加重脑水肿，从而出现神经功能恶化［7］。CRP是一种急性时相反应蛋白，由肝脏合成［8］。本实验数据显示，血清CRP的表达在6 h升高，在第3天达到最高值，第7天开始降低，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），与蓝业平等［9］的研究结论相一致。CRP还通过炎性反应来改善脑组织血液循环，减轻脑水肿［10］。另外，CRP可刺激血管内皮细胞促进内皮素及IL_6的释放［11］，还可使内皮细胞一氧化氮合酶（NOS）mRNA的稳定性降低，致使内皮细胞NOS表达的下降，从而诱发VEGF增加。VEGF是一种具有血管形成和血管通透性的细胞诱导因子［12］。本实验数据显示，VEGF在术后第6天开始升高，第3天最高，之后开始下降，其表达水平与脑出血引起的病情严重程度一致，说明脑出血可诱导VEGF的生成，与温中华等［13］的研究结果相一致。有研究显示，VEGF在脑出血后继发损伤及修复过程中起双层作用［14］。因此，AQP_4参与VEGF减轻脑出血后细胞凋亡的作用是其中的重要机制之一。

综上所述，脑出血继发脑水肿及炎性反应，导致AQP_4、CRP及VEGF升高，AQP_4与VEGF参与脑水肿和脑缺血的病理生理过程；CRP参与炎性反应过程；AQP_4、CRP、VEGF均参与脑出血的后反应过程，并有一定的动态变化规律；脑出血后AQP_4、CRP、VEGF呈现过度表达，其动态变化与大鼠脑出血后神经功能反应、脑细胞水肿具有一定的联系。推测三者均参与脑出血急性期脑水肿的形成与消退。

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Correlation between AQP_4，CRP，VEGF expression and brain edema after cerebral hemorrhage in rats

ZHANG Bo1LIU Jian2
1.Department of Neurosurgery，the First Peop1e′s Hospita1 of Guiyang，Guizhou Province，Guiyang　550002，China；2.Department of Neurosurgery，the Affi1iated Hospita1 of Guizhou Medica1 University，Guizhou Province，Guiyang　550004，China

［Abstract］Objective To make discussions over the expressions at different times AQP_4，CRP and VEGF after cerebra1 hemorrhage of rat as we11 as the re1evance with cerebra1 edema.Methods 90 rats were divided into two groups∶contro1 group　（inc1uding 18 rats）and experimenta1 group　（inc1uding 72 rats）.The contro1 group was the mode1 of fa1se b1eeding.As to the experimenta1 group，the stereo_tactic techniques were adopted to estab1ish the mode1 of cerebra1 hemorrhage of rats.After the cerebra1 hemorrhage，observations were made on the changes of rats′neuro1ogica1 functions at different time.After that，the heads of rats in the two groups were cut to get the brain.The ELISA method was adopted to test the serum CRP and VEGF，and the immunohisto_chemica1 method was adopted to test the brain tissue AQP_4. Results The foot imprinting test from grade 6 h to 14 d in the experimenta1 group were higher than those in the contro1 group（P＜0.05 or P＜0.01）.AQP_4，CRP and VEGF expression increased at 6 h，and increased obvious1y at 24 h，48 h，3 d and 7 d.Besides，the differences were significant（P＜0.01）.Conclusion After the cerebra1 hemorrhage，there is over_expression of AQP_4，CRP，and VEGF；besides，the dynamic changes are positive1y corre1ative with the neuro1ogica1 function reaction and cerebro_ce11u1ar edema.It is specu1ated that the above three factors have participated in the formation and regression of cerebra1 hemorrhage and edema.

［Key words］Incerebra1 hemorrhage；Aquaporin_4；C_reactive protein；Vascu1ar endothe1ia1 growth factor；Brain edema