生发酊对C57BL/6小鼠毛囊细胞凋亡的影响
张春洪
长春市中医院皮肤科，长春 130022
［摘要］目的从毛囊细胞凋亡的角度出发，观察生发酊对动物模型小鼠毛发生长周期的影响，评价其治疗脱发的效果。 方法将C57BL/6小鼠随机分为生发酊组、阳性对照组、阴性对照组、模型对照组，制备小鼠脱发动物模型。脱毛后第2天，于脱毛区涂相应药物；脱毛后第17天，颈椎脱臼处死小鼠，背部平行脊柱相同部位取材，用原位杂交技术原位末端标记法（TUNEL）检测毛囊内细胞的凋亡状况。 结果 生发酊组［（15.82±0.36）个/视野］与阳性对照组［（16.12±0.39）个/视野］细胞凋亡数量明显少于阴性对照组［（40.32±0.47）个/视野］与模型对照组［（42.16± 0.54）个/视野］，差异有统计学意义（P＜0.01）；生发酊组与阳性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 生发酊对毛囊细胞凋亡有明显的抑制作用，此为其治疗脱发的可能机制之一。
［关键词］生发酊；细胞凋亡；毛囊细胞
脱发是一种常见的疾病，在人群中的发病率较高，其发病机制尚不完全清楚。部分脱发具有先天遗传性，后天可能与精神、内分泌、感染、自身免疫、中毒等因素有关。毛囊是哺乳动物的特征性结构，近年来毛囊生物学受到广大皮肤病学者的广泛关注，毛囊成为研究细胞凋亡极好的生物系统［1］，由于其是毛发脱落最关键的器官，研究毛囊的生长特征、改善毛囊的生长环境是治疗脱发疾病的关键。我院皮肤科经过多年的临床研究，研制出用于治疗脱发疾病的自制中药外用制剂——生发酊，该药物经多年临床应用，显示出明显的乌发、生发的作用，效果显著，具有一定的应用价值。本实验目的在于阐明该药治疗多种脱发的作用机制，为临床应用提供一定的实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
C57BL/6小鼠，合格证号：SCXK（吉）2014_001，雌雄各半，清洁级，6周龄，体重19～21 g，共80只，由吉林大学实验动物中心提供。常规饲养，待小鼠适应环境后开始实验。
1.1.2 药物与试剂
生发酊全方由七味药组成，分别为补骨脂颗粒18 g、制首乌颗粒18 g、丹参颗粒18 g、生姜颗粒18 g、红花颗粒12 g、骨碎补颗粒12 g、桂枝颗粒18 g，共计药物总量114 g，药材购自北京康仁堂药业有限公司。上述药材加75%乙醇360 m1，冷浸1个月，中药免煎颗粒全部溶解于溶剂中，肉眼观察无明显颗粒沉淀，无菌条件装瓶备用。
75%乙醇，由长春市中医院皮肤科提供；乙醚，由长春中医药大学药理教研室提供；松香、石蜡、甲醛，二甲苯，由长春中医药大学病理教研室提供。
宝发堂六味防脱生发酊（国药准字B20020156），购于贵州百花医药集团。
1.1.3 实验仪器及设备
多聚赖氨酸载玻片，购自上海家和生物科技有限公司。SZX超净工作台、光学显微镜、FA1104型电子天平、数显恒温水浴锅、冷低温冰箱，均由长春中医药大学病理教研室提供。
1.2 方法
1.2.1 动物分组、造模、给药
1.2.1.1 分组 将80只近交系C57BL/6小鼠随机分为生发酊组、阳性对照组、阴性对照组、模型对照组，每组20只。前三组小鼠脱毛区分别对应外涂药物生发酊、宝发堂六味防脱生发酊、75%乙醇，模型对照组不涂任何药物。
1.2.1.2 造模 应用乙醚对小鼠进行麻醉，石蜡/松香混合物（1∶1）热融后，涂抹于小鼠背部，等待凝固变硬后，揭去夹杂鼠毛的石蜡/松香混合物。造模成功的标准：小鼠活泼，无烦躁、惊恐等特殊表现，以背部皮肤表面光滑，且无毛根、无伤为宜，脱毛面积约为2 cm× 2 cm，诱导其毛发由休止期进入生长期［2］，除此，小鼠无其他不良反应。
1.2.1.3 给药 脱毛后第2日起于脱毛区分别外涂对应实验药物，2次/d，每次0.25 m1/只。
1.2.2 毛囊细胞凋亡的检测
脱毛后第17天，将全部小鼠以颈椎脱臼法处死。于各组小鼠脱毛区相同部位取材，10%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片，铺片于多聚赖氨酸载玻片上，用原位杂交技术原位末端标记法（TUNEL）检测毛囊内细胞的凋亡状况，严格按照试剂盒说明书操作，具体方法：①用石蜡包埋组织切片；②将石蜡组织切片置染色缸中染色，用二甲苯浸洗2次，每次5 min；③用浓度为100%的乙醇浸洗2次，95%、85%、70%、50%的乙醇溶液依次各浸洗1次，每次3 min；④将组织切片用PBS浸洗5 min；⑤将组织切片置于10%甲醛溶液中固定15 min；⑥将组织切片用PBS浸洗2次，每次5 min；⑦将载玻片取出，水平放置，用吸水纸吸去多余液体，滴加100 μ1蛋白酶K溶液于样本区域，室温放置10～30 min；⑧将载玻片置于染色缸中，PBS浸洗3次，每次5 min；⑨取出组织玻片，吸水纸吸除多余液体，于样本区域滴加100 μ1的Equi1ibration Buffer，室温放置平衡5～10 min；⑩于平衡期间，将Biotin_ 11_dUTP置于冰上解冻，并配制TdT酶反应液，置于冰上待用；
11用吸水纸吸去多余液体，滴加100 μ1的TdT酶反应液于样本区域；
12将载玻片平铺于湿盒中，37℃温箱中反应60 min；
13滴加100 μ1稀释的Streptavidin_HRP反应液于样本区域，室温下反应3～5 min；
14PBS浸洗3次，每次5 min；
15在载玻片的样本区域滴加100 μ1 DAB工作液，室温孵育10 min；
16将组织切片用PBS浸洗3次，每次5 min；
17苏木精复染，中性树胶封片；
18光学显微镜下观察并拍照。将组织切片置于光学显微镜下观察，标记为褐黄色的物质即为凋亡小体，每张切片随机挑选凋亡阳性且染色最明显的部位，400倍镜下观察5个视野，计数各视野中的凋亡小体并取其均数。
11用吸水纸吸去多余液体，滴加100 μ1的TdT酶反应液于样本区域；12将载玻片平铺于湿盒中，37℃温箱中反应60 min；13滴加100 μ1稀释的Streptavidin_HRP反应液于样本区域，室温下反应3～5 min；14PBS浸洗3次，每次5 min；15在载玻片的样本区域滴加100 μ1 DAB工作液，室温孵育10 min；16将组织切片用PBS浸洗3次，每次5 min；17苏木精复染，中性树胶封片；18光学显微镜下观察并拍照。将组织切片置于光学显微镜下观察，标记为褐黄色的物质即为凋亡小体，每张切片随机挑选凋亡阳性且染色最明显的部位，400倍镜下观察5个视野，计数各视野中的凋亡小体并取其均数。1.3 统计学方法
采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（.jpg)
±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用X2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用X2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。2 结果
各组小鼠背部脱毛区毛囊内细胞凋亡的检测结果显示，脱毛后第17天，阴性对照组与模型对照组小鼠毛球部、外毛根鞘、内毛根鞘及隆突区均可见较多的凋亡细胞，毛囊细胞凋亡数分别为（40.32± 0.47）个/视野和（42.16±0.54）个/视野，而生发酊组与阳性对照组小鼠同期毛囊内散在凋亡细胞，毛囊细胞凋亡数分别为（15.82±0.36）个/视野和（16.12± 0.39）个/视野，生发酊组与阳性对照组细胞凋亡数量明显少于阴性对照组与模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。生发酊组与阳性对照组、阴性对照组与模型对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示生发酊对毛囊细胞凋亡有明显的抑制作用，且与宝发堂六味防脱生发酊效果相似，而其抑制作用与其溶剂酒精无明显相关性。
3 讨论
3.1 生发酊的组方依据及现代药理研究
3.1.1 组方依据
生发酊是我院皮肤科依据中医辨证论治理论创立的经验方，本方具有温肾通阳、养血生发等功效。方中制首乌、补骨脂同为君药，共奏温补精血，固肾乌须之功效；骨碎补为臣药，补肾助阳，破血活血，乃外用生发之良药；佐药红花、丹参行气活血、袪瘀生新、开启毛窍；生姜，助阳化气，活血生发；桂枝为使药，引药走表，加强温通经脉，助阳化气之功。
3.1.2 现代药理研究
现代研究表明何首乌具有一定的抗衰老作用，不仅含有丰富的毛发生长所必需的锰、锌等微量元素，可通过神经、内分泌和酶系统起到补肾、乌须发的作用，还含有3.7%的卵磷脂，能促进细胞的新生和发育，并可提高造血功能及机体免疫力。张兴洪等［3］通过实验发现，何首乌、女贞子等中药煎剂能在一定程度上抑制猪毛囊细胞凋亡，延缓毛囊由生长期进入退行期的进程。补骨脂除具有改善血液循环及抗菌作用外，还有一定的雌激素样作用。骨碎补能提高血钙和血磷水平，有一定的推迟细胞退行性变的作用，此外骨碎补双氢黄酮，对小鼠有明显的镇静作用。姜的乙醇提取液能兴奋心脏，对血管运动中枢有一定的兴奋作用。周睛等［4］研究发现雄激素源性脱发患者全血黏度、血浆黏度等均高于正常对照组，提示脱发与血液流变学变化存在相关性，血液瘀滞可能是本病发病机制之一。现代药理学研究表明，丹参对各种血浆成分有明显的降黏作用［5］，其有效成分可改善微循环，加强毛囊营养，促进毛发生长，其有效成分丹参酮具有一定的雌激素样作用，有抗雄性激素、调节免疫功能［6］及抗菌祛脂的作用。红花具有一定的抗炎作用，又能减轻脑组织中神经介质的代谢紊乱，使异常的神经介质恢复正常或接近正常，其有效成分红花黄色素能显著抑制家兔血小板聚集，并对已聚集的血小板发挥明显的解聚作用。桂枝中所含桂皮油、桂皮醛、挥发油分别具有调节血液循环、缓解神经紧张、抑菌抗炎的作用。孙颖［7］用心理干预对中重度斑秃、全秃、普秃患者进行辅助治疗，结果表明心理干预治疗组临床疗效优于对照组。还有研究也显示，心理安慰、疏导在本病治疗中尤显重要［8］。
3.2 所选动物模型的评价
C57BL/6小鼠是目前国内外广泛应用的研究毛发周期的动物模型。人类每个毛发毛囊的周期是不同步的，而该种小鼠可表现出独特的毛发周期同步性，故常用其作为研究毛发的动物模型［9_11］。拔毛法诱导的毛发周期与自发周期相比有两点不同：①自发的毛发生长期呈波浪式推进，而拔毛法诱导的毛发生长期是高度同步的；②拔毛区局部有轻微的炎症反应［12］。
3.3 实验探讨
毛囊是一个组成比较复杂的皮肤附属结构，由上皮（毛母质与外根鞘）和真皮（毛乳头和结缔组织鞘）两大部分组成。不同部位的毛囊在形状、形态上差别很大，但其基本结构相同［13］，其是一个周期性生长的微小器官。大多数哺乳动物的毛囊具有三个阶段的循环周期：生长期、退行期、休止期。正常人头发的生长状况因年龄和健康状况等因素的不同而不同。每天约有100根头发脱落进入休止期，持续约3个月。同时，也有等量的毛囊结束休止期而进入生长期。生长期持续约3年，90%的毛发处于这一期［14］。可以说多数毛发疾病都是由于毛囊生长期缩短或延长引起的，所以对毛囊周期调控机制的研究具有重要意义。
细胞凋亡是近些年研究毛发生长与循环周期的热点。毛囊从生长期到休止期是毛囊上皮周期性变化以部分细胞凋亡为特征的程序性器官退化与再生的过程［15］。细胞凋亡是机体在生长、发育及维持内部平衡过程中发生的受基因控制的有序的细胞死亡。凋亡细胞的形态特征表现为胞体缩小，失去胞间连接，胞浆浓缩，最终裂解为大小不等的凋亡小体。本次实验观察到生发酊对退行期毛囊内细胞凋亡有一定的影响：阴性对照组与模型对照组退行中晚期毛囊的毛球内、外毛根鞘、内毛根鞘存在大量凋亡细胞，而生发酊组与宝发堂六味防脱生发酊组可明显减少退行期毛囊内细胞凋亡，抑制毛囊进入退行期。
综上所述，自制中药生发酊外涂，可改善动物毛囊周围的环境，显著抑制毛囊细胞的凋亡，从而延长毛囊生长期，促进毛发的生长，改善毛发的质量，从而达到其治疗脱发的目的。
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Impact of hair_growth tincture on hair follicle cell apoptosis in animal model for C57BL/6 mice
ZHANG Chun_hong
Department of Dermato1ogy，Changchun Hospita1 of Traditiona1 Chinese Medica1，Changchun 130022，China
Department of Dermato1ogy，Changchun Hospita1 of Traditiona1 Chinese Medica1，Changchun 130022，China
［Abstract］Objective To observe the impact of hair_growth tincture on mice hair growth cyc1e in anima1 mode1 from the ang1e of hair fo11ic1e ce11 apoptosis and to eva1uate its effects in treatment hair 1oss.Methods C57BL/6 mice were random1y divided into hair_growth tincture group，positive contro1 group，negative contro1 group and mode1 contro1 group and then mice hair 1oss mode1 were made.Corresponding drugs were smeared to hair 1oss area from the second day after hair 1oss.Mice were ki11ed by cervica1 dis1ocation at the 17 day after hair 1oss.The samp1es were draw from same part of back para11e1 spine.In situ hybridization TUNEL was used to test the apoptosis condition of hair fo11ic1e ce11.Results The apoptosis number in hair_growth tincture group and positive contro1 group with a view of（15.82±0.36）ce11s and （16.12±0.39）ce11s were obvious 1ess than those in negative contro1 group and mode1 contro1 group with a view of （40.32±0.47）ce11s and （42.16±0.54）ce11s，and the differences were statistica1 significant（P＜0.01）.The difference between hair_growth tincture group and positive contro1 group had no statistica1 significance（P＞0.05）.Conclusion Hair_ growth tincture has obvious ro1e in inhibiting hair fo11ic1e ce11 apoptosis and this may be one of the mechanism in treating hair 1oss.
［Key words］Hair_growth tincture；Ce11 apoptosis；Hair fo11ic1e ce11
［中图分类号］R285.5［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）04（c）-0122-04
［作者简介］张春洪（1982_），女，吉林九台人，硕士，主治医师，研究方向：皮肤病的临床与实验研究
（收稿日期：2016_01_18本文编辑：卫 轲）