六味葛蓝降脂片对小鼠急性经口毒性及遗传毒性的试验研究
朱智德1　　蒋　林2　　罗宇东1，3▲　　陈洪涛1，3
1.广西中医药大学制药厂，南宁　530023；2.广西中医药大学成人教育学院，南宁　530001；3.广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室，南宁　530001
［摘要］目的开展六味葛蓝降脂片的遗传毒性和急性毒性试验，以评价其作为保健食品的毒理学安全性。方法根据《保健食品检验与评价技术规范》（原卫生部2003年版）食品安全性毒理学评价程序和检验方法的要求，进行急性经口LD50测定，通过小鼠精子畸形试验、小鼠骨髓微核试验及Ames试验评价其遗传毒性。　结果 六味葛蓝降脂片的急性经口LD50＞30 g/kg；3项遗传毒性试验结果均为阴性。　结论在本试验条件下，六味葛蓝降脂片急性经口毒性属无毒级，未见遗传毒性作用。
［关键词］六味葛蓝降脂片；急性毒性；遗传毒性
高脂血症为临床上的多发病及常见病，是引发脂肪肝、心脑血管疾病的重要病因之一。西药降脂疗效确切，但对人体的肝、肾等器官损害较大，因此临床应用范围受到一定限制。祖国传统中医药在防治高脂血症及心脑血管疾病等方面有着独特的优势［1_11］，中药治疗高脂血症副作用小，复发率低，具有广谱且多层次、多靶点、多途径降脂的优势，研究并开发降脂中药及保健食品具有广阔的市场空间。六味葛蓝降脂片为广西中医药大学制药厂拟开发的具有辅助降血脂功效的保健食品。前期功效学试验研究［12_13］表明，六味葛蓝降脂片具有调节血脂、预防动脉硬化、保护肝脏、缓解体重增长的功效。为评价产品的安全性，根据《保健食品检验与评价技术规范》（原卫生部2003年版）的要求，现进行六味葛蓝降脂片的急性经口毒性及遗传毒性作用试验。
1 材料与方法
1.1 样品和受试菌株
六味葛蓝降脂片由广西中医药大学制药厂生产，为棕褐色的片剂，产品批号：20130301，每片含生药量7 g，按成人口服推荐用量（2片/次，2次/d）计算，折合剂量为100.0 mg/kg体质量，试验前加无菌蒸馏水配制成相应的剂量；试验菌株和肝微粒体酶（S9）由广西壮族自治区中医药研究院提供，试验前经鉴定合格后使用。
1.2 主要仪器
SW-CJ-2D超净工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司）、RE501旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限公司）、JY501电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）、XFS-280压力蒸汽灭菌器（浙江新丰医疗器械有限公司）、HH-6数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）、LRH_250生化培养箱 （上海一恒科学仪器有限公司）、101-1恒温电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.3 动物来源
昆明种小鼠，清洁级，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK桂2014_0002。
1.4 试验方法
参照《保健食品检验与评价技术规范》（原卫生部2003年版）食品安全性毒理学评价程序和检验方法以及相关文献的方法进行试验［14-21］。
1.4.1 小鼠急性经口毒性试验　采用一次最大耐受量给予的方法，选择昆明种清洁小鼠20只（体质量18～22 g），雌雄各半，取受试样品配制成500 mg/m1浓度溶液给小鼠灌胃（0.40 m1/20 g体质量），每间隔4 h灌胃1次，灌胃3次，累积剂量达30 000 mg/kg体质量。试验前小鼠禁食（16 h）不禁水，灌胃后每周称量小鼠体重1次，连续观察14 d，记录动物的中毒症状及死亡情况，试验结束后处死动物并进行大体解剖观察，评价被检物的急性毒性强弱。
1.4.2 Ames试验　采用平板掺入法，分加入多氯联苯诱导的大鼠S9及不加入S9两种情况。受试品用蒸馏水配制成浓度为 0.08、0.40、2.00、10.00、50.00 mg/m1的溶液，采用四株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102进行试验。将0.10 m1受试物溶液、0.10 m1试验菌株和0.50 m1 S9混合液 （当需要代谢活化时）混合均匀后倒入培养皿中，37℃下培养48 h观察结果，同时设溶剂对照（用蒸馏水替代样品）、自发回变对照（不加样品，空白对照）和阳性突变剂对照，以直接计数培养基上长出回变菌落数的多少而进行结果评定。试验设8、40、200、1000、5000 μg/皿5个试验剂量，每个剂量做3个平行皿。试验在同样条件下重复做2次。如在背景生长良好条件下，受试回变菌落数增加1倍以上，即回变菌落数≥2×空白对照数，并有剂量反应关系即可认为该受试物为诱变阳性。
1.4.3 小鼠骨髓细胞微核试验　采用30 h给受试物法，即2次给受试物间隔24 h，第2次给受试物后6 h，颈椎脱臼处死动物。取昆明种小鼠50只（体质量25～30 g），雌雄各半，将其随机分成阴性对照（蒸馏水）、阳性对照（40 mg/kg体质量）剂量的环磷酰胺］和3个受试物剂量组（2500、5000、10 000 mg/kg体质量），每组10只小鼠。各组小鼠按相应剂量（0.40 m1/20 g体质量）灌胃，两次给药间隔24 h，第2次给药后6 h颈椎脱臼处死动物，取胸骨用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片，放入甲醇中固定，Giemsa应用液中染色，用光学显微镜观察并对微核进行计数，每只小鼠计数 1000个嗜多染红细胞（PCE），并以含微核的PCE千分率计算微核率，同时计算PCE（每只小鼠计数200个）与成熟红细胞的比值（PCE/NCE）。采用泊松分布进行数据处理，试验组与对照组相比，试验结果微核率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。
1.4.4 小鼠精子畸形试验 选择50只6～8周龄的昆明种雄性小鼠（体质量25～35 g），将其随机分成阳性对照（40 mg/kg体质量）剂量的环磷酰胺］、阴性对照（蒸馏水）和3个受试物剂量组（2500、5000、10 000 mg/kg体质量），每组10只小鼠。各组小鼠按相应剂量（0.40 m1/20 g体质量）灌胃，每天灌胃1次，连续5 d，最后1次灌胃后第30天处死小鼠，取出两侧附睾的精子，用甲醇固定5 min，1%伊红染色1 h，在光学显微镜下计算精子畸形率 （每只小鼠检查1000个完整的精子），用X2检验对数据进行统计分析，评价精子畸形阳性的标准是畸形率至少为阴性对照组的倍量或差异有统计学意义，并有剂量反应关系。
1.5 统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，小鼠骨髓微核试验数据采用泊松分布均数比较法，精子畸形试验数据采用X2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 六味葛蓝降脂片对小鼠的急性毒性试验结果
以30 000 mg/kg体质量的样品剂量（最大给药量）灌胃小鼠后，小鼠生长情况良好，未见有中毒症状，体重也未见异常，14 d观察期动物无死亡。试验结束动物解剖的大体观察，主要脏器如心、肝、脾、胃、肾、肺、肠等未见明显异常（表1）。样品急性经口毒性根据我国《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）的评价标准，属无毒级。
表1　六味葛蓝降脂片对小鼠的急性毒性试验结果

2.2 六味葛蓝降脂片Ames试验结果
无论加入S9与不加入S9，对于四种试验菌株TA97、TA98、TA100、TA102，受试物的各剂量组回变菌落数与自发回变菌落数比较，均没有增加1倍以上，也无剂量反应关系（表2、表3），表明该受试物为诱变阴性。
表2　六味葛蓝降脂片Ames试验结果（第1次，±s）

表3　六味葛蓝降脂片Ames试验结果（第2次，±s）

阳性对照：TA97a+S9、TA98+S9、TA100+S9采用2_氨基芴（剂量为10 μg/皿）；TA97_S9、TA102_S9采用敌克松（剂量为50 μg/皿）；TA100_S9采用叠氮钠（剂量为1.5 μg/皿）；TA102+S9采用1，8_二羟基蒽醌（剂量为50 μg/皿）；TA98_S9采用柔毛霉素（剂量为6 μg/皿）。
2.3 小鼠骨髓细胞微核试验
受试物各剂量组骨髓细胞微核率与阴性对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），阴性对照组的骨髓细胞微核率显著低于环磷酰胺阳性对照组 （P＜0.01）。各组的PCE/NCE比值也处于正常的范围内，小鼠骨髓细胞微核试验结果为阴性（表4）。
表4　六味葛蓝降脂片对小鼠骨髓细胞微核发生率的影响

 
与阴性对照组比较，**P＜0.01；cp为环磷酰胺
2.4 小鼠精子畸形试验
受试样品的阳性对照组与阴性对照组比较，小鼠的精子畸形率显著升高，差异有统计学意义 （P＜0.01）；样品各剂量组精子畸形率与阴性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表5），表明该样品对小鼠精子畸形试验的结果为阴性。
表5　六味葛蓝降脂片对小鼠精子畸形发生率的影响

 
与阴性对照组比较，**P＜0.01；cp为环磷酰胺
3 讨论
六味葛蓝降脂片的主要成分为绞股蓝、火麻仁、决明子、葛根、沙棘等药食同源药材，根据中医药君、臣、佐、使理论，方中的绞股蓝、火麻仁为君药，绞股蓝益气养阴，益脾补虚，而火麻仁润肠通便，用于血虚津亏，肠燥便秘；决明子为臣药，能平肝、清热明目，润肠通便；佐以葛根解肌退热，升阳透疹，生津止渴，沙棘消食化滞，活血散瘀；荷叶升发清阳，化除湿浊；诸品配合，诸症兼顾，相得益彰，共奏益气健脾，升发清阳，除湿化痰，降浊消脂之功。本品通过调节机体的代谢功能，从而达到多靶点、多环节整体协调降血脂的功能。本实验考察了六味葛蓝降脂片对小鼠的急性毒性及遗传毒性作用，试验结果表明，该产品的三项遗传毒性试验（小鼠精子畸形试验、小鼠骨髓细胞微核试验、Ames试验）均为阴性，急性经口毒性试验根据我国《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）的评价标准属无毒级，表明六味葛蓝降脂片是一种服用安全的保健食品。
［参考文献］
［1］卢熠，杨悦.降血脂药物的临床应用与展望［J］.中国当代医药，2014，21（5）：180-182.
［2］郭东杰，袁肖寒，蔡曼，等.降血脂西药与中药研究现状与展望［J］.黑龙江医药，2014，27（1）：32-36.
［3］杜志澎.高胆固醇与心血管危险因素相关性研究［J］.中国当代医药，2013，20（2）：7-8.
［4］苏蓉，于德水.高脂血症的危害及防治［J］.中国当代医药，2009，16（8）：128-129.
［5］刘石.调血脂药物的研究进展［J］.北方药学，2013，10（10）：94.
［6］刁玉林，刘祎，孟大利.降血脂天然产物研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2009，26（12）：1008-1012.
［7］辛丹丹，宝贵荣，博·格日勒图，等.国内外降脂药物的研究进展［J］.内蒙古中医药，2013，32（21）：149-151.
［8］吴栩，孙晓茂.中医药治疗高脂血症研究概述［J］.中医研究，2013，26（3）：73-75.
［9］李文雄，孙赫，刘文婷.中医药治疗高脂血症研究进展［J］.河南中医，2015，35（2）：439-441.
［10］王丹丹，李难，张闻东.中医药治疗高脂血症的研究进展［J］.黑龙江中医药，2014，43（3）：72-74.
［11］周泽，陈晓虎.中医药治疗高脂血症研究进展述要［J］.实用中医内科杂志，2011，25（3）：24-25.
［12］罗宇东，蒋林，许梦寒，等.蓝参降脂方对高脂模型小鼠血脂水平的影响［J］.中国当代医药，2013，20（18）：4-5.
［13］罗宇东，蒋林，刘源焕，等.蓝参降脂片对高脂模型大鼠血脂水平的影响［J］.广西中医药，2015，38（2）：72-74.
［14］中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范［Z］.北京：卫生部卫生法制与监督司，2003：829.
［15］王心如.毒理学基础［M］.4版.北京：人民卫生出版社，2003：136.
［16］国家标准汇编.GB15193.7_2003小鼠精子畸形试验［M］.北京：中国标准出版社，2004.
［17］林梁鹏，李大伟，张士康，等.酰化茶多酚的急性毒性与遗传毒性试验研究［J］.中国食品添加剂，2014，（9）：65-70.
［18］刘秀英，胡怡秀，易传祝，等.苦瓜醇提取物对小鼠的急性经口毒性和遗传毒性试验研究［J］.癌变·畸变·突变，2007，19（5）：381-383.
［19］侯震，胡向科.白藜芦醇对小鼠的急性经口毒性和遗传毒性试验研究［J］.癌变·畸变·突变，2011，23（3）：213-215.
［20］胡怡秀，刘秀英，马征，等.月见草油急性毒性与遗传毒性实验观察［J］.实用预防医学，2009，16（1）：61-63.
［21］曹丽，刘岩，隗维，等.朴菇多糖的急性毒性及遗传毒性试验研究［J］.癌变·畸变·突变，2008，20（5）：406-408.
Study on the acute and genetic toxicities of Liuwei Gelan lipid_lowering tablets in mice
ZHU Zhi-de1        JIANG Lin2        LUO Yu-dong1，3▲　CHEN Hong-tao1，3
1.Pharmaceutica1 Factory，Guangxi University of Traditiona1 Chinese Medicine，Nanning　530023，China；2.Adu1t Education Co11ege，Guangxi University of Traditiona1 Chinese Medicine，Nanning　530001，China；3.Key Laboratory，Generic Techno1ogy Deve1opment of Chinese Medicine Preparation in Guangxi Universities，Nanning　530001，China
［Abstract］Objective To determine the acute ora1 toxicity and genetic toxicity of Liuwei Ge1an 1ipid-1owering tab1ets. Methods The acute ora1 LD50test was performed，and the genetic toxicity was eva1uated by mouse sperm abnorma1ity test，bone marrow micronuc1eus test and Ames test according to the requirements of the《hea1th food inspection and eva1-uation of technica1 specifications》（former1y the Ministry of hea1th in 2003 Edition）food safety toxico1ogy eva1uation procedures and test methods.Results The acute ora1 LD50of Liuwei Ge1an 1ipid-1owering tab1ets was greater than 30 g/kg. The genetic toxicity indicated by Ames test，micronuc1eus test of po1ychromatic erythrocytes in bone marrow and sperm shape abnorma1ity test in mice was negative.Conclusion In our experimenta1 condition，the acute toxicity of Liuwei Ge1an 1ipid-1owering tab1et is c1assified as non-toxic.Genetic toxicity is not found.
［Key words］Liuwei Ge1an 1ipid-1owering tab1ets；Acute toxicity；Genetic toxicity
［中图分类号］R965.3
［文献标识码］A
［文章编号］1674-4721（2016）04（c）-0004-04
［基金项目］广西科学研究及技术开发项目（桂科攻1412400 4-2-7）；广西高校科技创新能力提升工程专项项目（70-ZJGX 201404003）；广西高等学校特色专业及课程一体化建设项目（GXTSZY014）
［作者简介］朱智德（1974-），男，汉，广西宾阳人，副教授，研究方向：药品及食品的研究与开发
▲
通讯作者：罗宇东（1974-），男，汉，广西藤县人，硕士，副主任药师，研究方向：保健食品及新产品的研究与开发
（收稿日期：2015-12-15　本文编辑：王红双）