杨　彪1　李新呜2　严思远2　陈冬梅2　牛佳钰2　肖纯凌2▲
1.辽宁中医药大学，沈阳　110032；2.沈阳医学院环境污染与微生态重点实验室，沈阳　110034

［摘要］目的探讨PM2.5暴露对鸦胆子油乳治疗荷瘤肺癌小鼠腹腔巨噬细胞的活性调节作用。方法建立肺癌荷瘤A549细胞小鼠模型32只，随机分为4组：治疗组1（鸦胆子油乳治疗组）和对照组1，治疗组2（PM2.5暴露联合鸦胆子油乳治疗组）和对照组2，每组8只。收集腹腔巨噬细胞，检测520 nm吸光度值。结果腹腔巨噬细胞吞噬能力显示，治疗组1高于对照组1，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组2低于对照组2及治疗组1高于治疗组2，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论PM2.5暴露对鸦胆子油乳治疗荷瘤肺癌小鼠腹腔巨噬细胞的活性有抑制作用。

［关键词］空气细颗粒物；鸦胆子油乳；荷瘤小鼠；腹腔巨噬细胞

Effect of PM2.5 exPosure for Peritoneal macroPhages of tumor-bearing mice with lung cancer treated by bruceolic oil emulsion

YANG Biao1LI Xin-ming2YAN Si-yuan2CHEN Dong-mei2NIU Jia-yu2XIAO Chun-ling2▲
1.Liaoning University of Traditiona1 Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2.Key Lab of Environmenta1 Po11ution and Microeco1ogy，Shenyang Medica1 Co11ege，Shenyang 110034，China

［Abstract］Objective To exp1ore active regu1ating effect of PM2.5 exposure for peritonea1 macrophages of tumor-bearing mice with 1ung cancer treated by bruceo1ic oi1 emu1sion. Methods 32 mouse mode1s in tumor-bearing A549 ce11 in 1ung cancer were random1y divided into 4 groups:treatment group 1 (bruceo1ic oi1 emu1sion treatment group) and contro1 group 1，treatment group 2 (PM2.5 exposure combined with bruceo1ic oi1 emu1sion treatment group) and contro1 group 2. Each group had eight mice.Peritonea1 macrophages from these mice were co11ected and 520 nm absorbance degree va1-ue was detected. Results phagocytic abi1ity of peritonea1 macrophage indicated that treatment group 1 was higher than that of contro1 group 1，and there was a statistica1 difference (P＜0.05).The phagocytic abi1ity in the treatment group 2 was 1ower than that of contro1 group 2，and the phagocytic abi1ity in the treatment group 1 was higher than that of treatment group 2，and there was a statistica1 difference (P＜0.01). Conclusion PM2.5 exposure has inhibiting effect for activity of peritonea1 macrophages in tumor-bearing mice with 1ung cancer treated by bruceo1ic oi1 emu1sion.

［Key words］Fine particu1ate matter in air；Bruceo1ic oi1 emu1sion；Tumor-bearing mouse；Peritonea1 macrophages

空气污染物由多种资源消耗的途径产生，并可以损伤人体的健康和破坏自然环境。空气污染物由室内和室外污染物组成，包括基本颗粒（灰尘和碳颗粒），气体成分（一氧化碳、氮气、硫氧化物和臭氧），有机复合物，部分农药（二恶辛类）和某些生物制品材料，当这些污染物进入呼吸系统时，就可能有潜在的毒性作用[1]。对人类的健康来说，颗粒混合物的成分是最主要的危险因素。相关的文献报道了颗粒物组分与日常死亡率和入院率的相关性[2-3]。针对空气颗粒物的研究不仅可以为某些疾病的预防工作奠定基础，也可以更好地阐述受到空气污染后相关疾病的致病机制，通过发现新的细胞反应，提高对细胞途径的理解，最终发展成新的有效的预防和治疗疾病的手段。

鸦胆子油乳，是由中药鸦胆子[Brucea javanica（L.）Merr.]干燥的成熟果实提取的脂肪油经乳化作用制成的水包油型乳剂，其主要活性成分油酸及亚油酸具有很强的抗癌活性，与肿瘤细胞膜有特异的亲和力[4]。研究表明，鸦胆子油乳可用于肺癌、食道癌、直肠癌、肝癌、前列腺癌等的治疗，对多种恶性肿瘤细胞均具有诱导凋亡的作用，可逆转多种癌细胞的多药耐药，临床上多采用鸦胆子油乳作为逆转剂与常用抗癌药合用治疗产生耐药性的肿瘤[5]。本研究主要探讨PM2.5暴露对鸦胆子油乳治疗荷瘤肺癌小鼠腹腔巨噬细胞活性调节的效果。

1.1　试剂和仪器

鸦胆子油乳：沈阳药大药业有限责任公司；脂多糖（LPS）：Sigma公司；中性红：Amresco公司；0.4%台盼蓝染色液：北京索莱宝科技有限公司；A549细胞株购置于南京凯基生物发展有限公司；RPMI1640培养液：GIBCO公司；胎牛血清：浙江天杭生物科技股份有限公司；胰蛋白酶-EDTA消化液：GIBCO公司；青霉素链霉素溶液：Hyc1one公司；磷酸缓冲液（PBS）：Hyc1one公司；75%乙醇；生理盐水。96孔板：康宁公司；100 mm细胞培养皿：康宁公司；15 m1离心管，康宁公司；50 m1离心管，康宁公司。

1.2　实验动物

32只清洁级雄性CB17-SCID小鼠[体重22～24 g，许可证号：SCXK（京）2012-0001]购于北京维通利华动物实验动物技术有限公司，常规饲养于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级动物房内，12/12 h昼夜光照，动物房温度为22～24℃，湿度为70%。伦理要求：实验CB17-SCID小鼠符合动物福利和伦理要求，实验方案获学校伦理委员会批准。

1.3　建立模型及分组

A549细胞株使用RPMI-1640完全培养基在37℃和5% CO2条件下培养。RPMI-1640培养基中加入10%胎牛血清，100 U/m1的青霉素和100 μg/m1的链霉素。取对数增长期A549细胞，0.4%台盼蓝染液染色，显微镜下进行活细胞计数，确保细胞活性＞95%，生理盐水调整浓度至2.5×106个/m1于小鼠尾静脉注射。尾静脉注射A549细胞5×105个/只，建立荷瘤小鼠模型，经过活体解剖检查，成瘤率为80%以上。小鼠全部为雄鼠，采用随机数表法分为4组：治疗组1（鸦胆子油乳治疗组）和对照组1，治疗组2（PM2.5暴露联合鸦胆子油乳治疗组）和对照组2，每组8只。6周后，完成对应实验组的灌胃和气管滴注操作。每2天灌胃鸦胆子油乳200 μ1，共14次；每隔3天气管滴注PM2.5 20 μ1，共7次。

1.4　腹腔巨噬细胞的收集及培养方法

实验第20天在超净工作台内按动物福利学将荷瘤肺癌小鼠脱颈处死，向腹腔注入预冷PBS 5 m1，顺时针轻揉腹部，使用一次性巴氏吸管取出灌洗液。将灌洗液以1200 r/min，离心5 min，弃上清液，用RPMI1640完全培养液重悬细胞，调整细胞浓度至2×105个/m1，细胞接种到96孔细胞培养板中，100 μ1/孔，细胞培养板放置于37℃，5% CO2的培养箱。

1.5　巨噬细胞吞噬功能的测定

培养12 h弃上清。加入LPS 200 μ1/孔，放置于培养箱中，培养24 h取出细胞板，弃上清，加0.01%中性红溶液，100 μ1/孔，继续于培养箱中孵育。3 h后取出细胞板，弃上清并用生理盐水洗5遍，加入细胞裂解液（醋酸与无水乙醇等体积混合）50 μ1/孔，振荡10 min后，用Infinit M200测定520 nm波长吸光度值。

1.6　PM2.5暴露鸦胆子油乳干预荷瘤肺癌小鼠生理指标检测

随着鸦胆子油乳和PM2.5实验的顺利进行，每周完成1次荷瘤肺癌小鼠的体重指标测量，每只鼠每次重复3次体重测量。

1.7　统计学处理

统计分析用GraphPad PRISM 5.0（SAS，Cary，NC，USA）软件完成。所有的实验内容至少重复3次，结果比较采用非配对双侧t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1　巨噬细胞的吞噬能力

腹腔巨噬细胞吞噬能力通过520 nm吸光度值检测结果如图1所示，治疗组1与对照组1，治疗组2与对照组2，治疗组1与治疗组2，分别比较，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。治疗组1腹腔巨噬细胞的吞噬能力最强，治疗组2腹腔巨噬细胞的吞噬能力最弱。

 

图1　O.O1%中性红实验结果

治疗组1高于对照组1，*P＜0.05；治疗组2低于对照组2及治疗组1高于治疗组2，***P＜0.01

2.2　4组体重均数变化情况

6周后，按照分组的方法处理肺癌荷瘤小鼠，如图2所示，治疗组1、对照组1和对照组2肺癌荷瘤小鼠体重呈递增趋势无明显变化；治疗组2体重下降趋势明显，说明PM2.5暴露能影响鸦胆子油乳治疗肺癌荷瘤小鼠的生活质量。

 

图2　4组体重均数变化情况

全球多地的研究已经表明空气污染颗粒物对人体健康的危害。研究发现，环境细颗粒物能够诱导机体呼吸道上皮细胞产生过多的氧自由基，发挥颗粒物毒性作用，极大地干扰了受侵袭细胞的自身生理活动，使一部分细胞无法适应周围新的生存环境，发生多种途径死亡[6-7]；通过PM2.5暴露处理大鼠会引起其发生呼吸系统病变，并致使其促炎和抗炎因子失衡，发生炎性损伤[8-10]，类似的实验结果在戴海夏等[11]的科研结果中也有表明。

本研究使用的PM2.5样品由硝化棉滤膜收集获得，并且进行PM2.5样品成分分析[9-12]。采样器使用Hi-Vo1 PM2.5采样头将空气动力学直径＜2.5 μm的颗粒通过撞击区沉降到采样器的过滤膜上，流量为1.13 m3/min。超声震荡收集PM2.5颗粒物，用PBS缓冲液溶解的PM2.5浓度为20 mg/m1，在-80℃的低温环境中保存，使用时超声震荡处理。通过对PM2.5样品的成分检测，发现主要成分包括一些重金属元素和不同浓度的多环芳烃类物质。

鸦胆子油乳的主要活性成分油酸及亚油酸对正常细胞无明显损害，具有很强的靶向性作用，可以直接杀伤癌细胞阻断癌细胞的增殖，对癌细胞质膜系统、线粒体及粗面内质网等细胞器均具有破坏作用，此外，还具有增强人免疫功能和骨髓造血功能的作用[13]。

本研究中，在新环境条件干扰下，通过体内实验模拟空气污染状况在不断加剧情况下，探讨鸦胆子油乳治疗对肺癌荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞活性的影响及生理指标体重的改变情况。检测腹腔巨噬细胞吞噬能力结果说明PM2.5暴露对鸦胆子油乳治疗荷瘤肺癌小鼠腹腔巨噬细胞的活性有抑制作用。巨噬细胞是一类重要的免疫细胞和炎性细胞，能够启动体内的炎症介质产生，并调控炎症反应，释放炎性细胞因子[14]。巨噬细胞在病理生理、反应中起核心作用，如炎症、器官愈合和再生[15]。此外，巨噬细胞参与宿主防御和细胞毒性介质释放的肿瘤细胞的直接破坏[16]。检测520 nm的吸光度值结果显示，鸦胆子油乳治疗组1腹腔巨噬细胞的吞噬能力最强，生理指标检测结果显示体重呈递增趋势无明显变化，说明鸦胆子油乳可以显著改善肺癌荷瘤小鼠的机体免疫能力和生活质量。

综上所述，本研究探讨空气细颗粒物暴露对鸦胆子油乳治疗荷瘤肺癌小鼠腹腔巨噬细胞的活性调节作用，明确了当空气污染物明显增加时，鸦胆子油乳治疗荷瘤肺癌小鼠的腹腔巨噬细胞活性发生变化，进一步说明PM2.5暴露可以对荷瘤肺癌小鼠的免疫系统产生影响，确定了预防PM2.5继续发展的必要性。必须在空气污染颗粒物影响的基础上，合理设计动物实验，建立更为详尽的有关基因及其表达蛋白和各种相关转录因子的数据库，分析其在人和动物细胞或组织中的表达形式、作用特点及其相关性，从而在分子水平上为疾病的治疗提供更直接、更有价值的依据，为人类的生命健康作出新贡献。

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收稿日期：（2016-01-05　本文编辑：许俊琴）

通讯作者：▲肖纯凌（1964-），女，教授，博士生导师，主要从事大气污染对呼吸道的影响机制及微生态研究

［作者简介］杨彪（1984-），男，辽宁省辽阳县人，2014级在读博士研究生，主要从事环境污染物对机体健康影响的研究

［基金项目］辽宁省沈阳市重点实验室建设专项（F14-181-1-00）；辽宁省沈阳市科技计划项目（F13-221-9-36）；辽宁省沈阳市公益类科技项目

［中图分类号］R332　

［文献标识码］A　

［文章编号］1674-4721（2O16）O2（c）-OO15-O4