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中药和天然产物通常是药物发现的最佳来源[1]。柚皮苷又名柚甙、柑橘甙、异橙皮甙，是一种天然化合物，其分子结构如图1。柚皮苷是中药骨碎补、枳实、枳壳、橘红的主要活性成分。柚皮苷是一种天然双氢黄酮类化合物，得益于其A 环和B 环之间不存在共轭关系，其在282 nm 存在强烈的紫外线吸收峰，表现出丰富的生物学活性以及药理作用。现代药理研究表明，柚皮苷具有保护软骨组织、促进成骨细胞增殖与分化、抗氧化、抗炎等药理学作用[2-7]。对于像柚皮苷这样的天然化合物，关于其毒性和药物性质的了解往往早于对其作用目标靶点或作用机制的研究及精确了解。因此，关于柚皮苷药理作用机理、分子靶点的认识，亟须进一步探讨。

网络药理学是从分子、网络、细胞，到组织、器官等各个水平上研究药物治疗疾病时引起机体功能变化机制，从微观（分子、生化网络水平）到宏观（组织、器官、整体水平）建立药物对机体的作用机制的一门学科。采用网络药理学的方法探讨药物的分子机制，已经成为当今主流，越来越受到科研工作者们的青睐，因为通过这样的研究方法可以节省时间、金钱和精力[8-9]。通过网络药理学的方法，可以推断分子作用靶点及调控通路，有助于药物的发现和改善药物的设计过程，从而解决未满足的医疗需求[10]。Ye 等[11-12]通过网络药理学的方法，分别明确了辣椒素（capsaicin）和丹参酮Ⅱa（tanshinone Ⅱa）的潜在靶点。作为一种来自于传统中药的活性化合物，柚皮苷同样适合这种类型的分析。因此，本研究借助网络药理学的方法，从分子机制探讨柚皮苷的分子作用机制。

图1 柚皮苷的分子结构

a：柚皮苷的2D 结构；b：柚皮苷的3D 结构

1 材料与方法

1.1 柚皮苷的药理和分子性质评价

从中药系统药理学数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）数据库中获取柚皮苷吸收、分布、代谢和排泄（absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME）性质评价相关信息，如口服利用度（oral bioavailability，OB）、类药性（drug-likeness，DL）、血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）、分子量（molecular weight，MW）、脂水分配系数（fractional water accessible surface area of all atoms with negative partial charge，AlogP）、氢键供体数（Hbond donor，Hdon）、拓扑分子极性表面积（topological polar surface A，TPSA）、氢键受体数（Hbond acceptor count，Hacc）、可旋转键（rotating bond，RBN）等。DL 是药物设计的一种定性概念，用于评估一种化合物的类药程度，有助于优化药物代谢动力学和药物性能[13]。TCMSP 和分析平台收集《中华人民共和国药典》（2015年版一部）中499 味草药及其化合物成分的数据，还可以提供每个化合物的人体ADME 性质评价数据[13]。

1.2 柚皮苷药物作用靶点查询

从GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库检索获取柚皮苷潜在靶标候选物，根据评分≥2.0，候选靶点为人类进行靶点筛选。GeneCards 是一个综合数据库，基本覆盖了几大数据库对于基因的分析数据，其可以提供简明的基因组、蛋白质组、转录、遗传和功能上所有已知和预测人类基因。并和Uniprot（http://www.uniprot.org/）数据库进行比对筛选。Uniprot是一个收录蛋白质序列最广泛、功能注释最全面的一个集中收录蛋白质资源的数据库，并且其能和其他不同功能的数据库相互联系。

1.3 GeneMANIA 分析

GeneMANIA（http://www.genemania.org）是一个灵活的、用户友好的web 界面，用于生成关于基因功能的假设、分析基因列表和为功能分析确定基因的优先级[14]。输入既定的基因列表，GeneMANIA 使用可用的基因组学和蛋白质组数据识别功能相似的基因扩展该列表[14]。GeneMANIA 还报告了用于查询的每个选定数据集预测值的权重[14]。

1.4 基因本体论（gene ontology，GO）分析、通路分析及可视化网络的构建

GO 是描述基因产物功能，广泛应用在生物信息学领域的一个本体[15]。作为一个广泛应用于基因功能分类的系统，其涵盖生物学的三个方面：细胞组分、分子功能、生物功能[15]。GO富集分析应用分子注释系统（Molecule Annotation System 3.0，MAS 3.0）进行。该系统可以帮助理解基因表达数据之间的关系，并提供全面、可视化的有关目标基因的信息。通过MAS 3.0 可以收集到柚皮苷的GO 富集信息和KEGG 通路信息。获得相关信息后，通过Cytoscape 3.6.1 软件进行网络的构建和分析[16]。主要方法及路线见图2。

图2 柚皮苷药理作用机制研究的主要方法及路线

2 结果

2.1 柚皮苷的药理和分子性质

DL 是用于评估一种化合物类药程度的指标，有助于优化药物代谢动力学和药物性能，化合物的DL值≥0.18 被认为筛选中药生物活性化合物的合适标准[13，17-18]。通过TCMSP 得到的柚皮苷的药理及分子性质：MW 为580.59，AlogP 为-0.46，Hdon 为8，Hacc 为14，OB 为6.92，BBB 为-3.00，TPSA 为225.06，RBN 为6，DL 为0.78。值得注意的是柚皮苷的DL 值为0.78，远高于0.18 水平，因此表明柚皮苷可能是一种富有良好前景的药物。

2.2 靶点预测结果

从GeneCards 数据库中筛选出Score≥2.0 靶点共19 个，并和Uniprot 数据库比对筛选，其中3 个未找到匹配信息予以剔除，2 个靶点Uniprot 数据库中对应物种非人类。其余靶点及基因如表1所示。

2.3 GeneMANIA 分析结果

在14 个靶标及其相互作用蛋白中，65.18%表现出相似的共表达特征（Co-expression），17.30%存在共同的通路（Pathway），12.39%有着共同的蛋白质域（Shared protein domains），其余结果如物理交互（Physical interactions）、协同定位（Co-localization）如图3（封三）所示。

图3 GeneMANIA 分析结果（见内文第14 页）

表1 靶点预测结果

2.4 GO 富集和通路分析以及网络构建

为了进一步研究筛选得到的14 个目标基因，使用MAS 3.0 对交互作用网络进行分析研究，结果如表2和图4（封三）所示。前五项功能分别是细胞过程（GO:0009987 cellular process）、生理过程（GO:0007582 physiological process）、生物调节（GO:0065007 biological regulation）、生物进程的调节（GO:0050789 regulation of biological process）、发育过程（GO:0032502 developmental process），共约占46%。KEGG 通路分析排行前25 的通路见表3。基于靶点及其通路分析结果，通过Cytoscape 3.6.1 进行可视化网络的构建，如图5（封三）所示。

图4 基于MAS 3.0 分析结果（见内文第14 页）

图5 柚皮苷-靶点-通路可视化网络图（见内文第14 页）

红色矩形：柚皮苷；绿色三角形：靶点；蓝色圆圈：通路

3 讨论

一种化合物的药物代谢动力学特性及药物毒性不符合药物研发的要求是导致药物开发后期失败的重要原因，越来越多的学者认为这些方面的因素应该在药物发现过程中得到优先考虑[19]。通过网络药理学的方法，可以提高预测和模拟药代动力学、代谢过程和毒性终点的能力，从而达到简化和加速药物发现过程的目的[19]。

在有机小分子药物设计中，很多小分子候选化合物往往具有很好的体外活性，但是一旦进入下一步动物实验的时候，在体的药理活性常常得不到很好的结果。当出现这种情况的时候往往涉及到药代动力学范畴，资深药物化学家克里斯多夫·里宾斯基[20-21]提出筛选类药分子的五规则：①化合物的分子量小于500 道尔顿；②化合物结构中的Hdon（包括羟基、氨基等）不超过5 个；③化合物结构中的Hacc 不超过10 个；④化合物的AlogP 在-2～5 之间；⑤化合物中RBN 的数量不超过10 个。符合里宾斯基无规则的化合物会有更好的药代动力学性质，在生物体内代谢过程中会有更高的生物利用度，因而也更有可能成为口服药物。在药物研发领域，该规则被应用于对化合物的初筛，以达到摒除那些不适合成为药物的分子，缩小筛选范围并降低药物研发成本[22]。在长期的实践过程中，五规则被简化为“四规则”和“三规则”，“四规则”去掉了关于RBN 的数量限制；“三规则” 则进一步去掉了对Hacc 量的限制[21]。柚皮苷的分子属性基本能符合“三规则”。

表2 潜在靶点的GO 富集分析

DL 这一概念是通过对现有小分子药物和（或）候选药物物理化学性质和或结构特征的分析而建立起来的，并且被广泛应用于化合物的筛选，通过DL 可以过滤掉那些药物代谢动力学性质较差的化合物[23]。化合物的DL 值≥0.18 被认为筛选中药生物活性化合物的合适标准[13，17-18]。

靶标识别是药物发现的第一步，越来越多的药物或活性化合物的作用方式呈现出多靶点的特点[24]。通过网络药理学的方法可以预测药物或活性化合物的作用靶点[24-25]。本研究中，通过这样的方法得到了柚皮苷的14 个潜在靶标。从通路富集分析结果可知，柚皮苷预测靶点基因主要和癌症、骨代谢、抗炎、抗氧化等通路相关。其中，柚皮苷可能主要通过Wnt 信号通路、TGF-β 信号通路、MAPK 信号通路、破骨细胞信号通路（Osteoclast differentiation）等直接影响骨代谢，通过P13K-Akt、VEGF 信号通路等间接调节骨代谢，具有抗骨质疏松的作用。其抗癌机制预测结果主要通过影响内分泌抑制信号通路（Endocrine resistance）、癌症途径（Pathways in cancer）、癌症中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）等信号通路，抗炎抗氧化机制主要通过干预MAPK 信号通路、TOLL 样受体信号通路等。目前，柚皮苷的部分靶点相关研究已经明确。Li 等[26]通过实验证明载柚皮苷壳聚糖底物能通过激活Smad 受体（TGF-β 信号通路中）而激活成骨蛋白Smad 的信号传导，并证实了柚皮苷能促进成骨蛋白的表达，包括Ⅰ型胶原蛋白、骨唾液酸蛋白以及骨钙蛋白。这和本研究得到柚皮苷前5 个通路中的胶原分解代谢过程和SMAD 蛋白通路的结果一致。同时研究也证实了柚皮苷能增加成骨细胞标志蛋白（如骨钙蛋白、骨形成蛋白、骨桥蛋白等）的表达，并且能够抑制RANKL[re-ceptor activator of nuclear factor-kappa B（NF-κB）ligand]通路，抑制破骨细胞形成，而达到延缓骨质疏松，促进成骨的作用[27-28]。李风波等[29]研究指出，柚皮苷可以下调破骨细胞分化过程中RANK、TRAP、MMP-9、NFATc1、mRNA 以及上调C-fos mRNA 的表达，进而影响破骨分化和骨吸收作用。Song 等[30]通过动物实验推断出柚皮苷能通过调节VEGF/VEGFR-2 通路来激发血管再生。研究也证实了柚皮苷在抗炎、调脂、抗氧化等的作用机制[31-35]。因此，通过网络药理学的方法可预测得到柚皮苷的作用机制呈现多靶点的特性，GeneMANIA分析结果提供了共表达和共同蛋白质域的信息，提示靶标及其相互作用可能具有相同或类似功能。通过对现有数据库进行数据挖掘，得到的信息进行整理和分析后得出与临床实践和药理研究结论相似，并且结果更为详实、可靠。本研究通过MAS 3.0 进行GO 和Pathway 分析，并应用Cytoscape 构建可视化网络，直观地展示了得到的结果。

表3 KEGG 通路富集结果

中药具有多成分的特点，其化合物作用机制也呈现多靶点特性。网络药理学的提出和应用，从整体水平以及分子水平为其研究提供了科学的理论和方法，有助于研究中药天然化合物及新药的研发，并且对促进中医中药理论的发展和中西医药的结合具有深远的意义。综合运用网络药理学的方法有助于快速全面地预知化合物的药理作用机制，并为下一步实验验证提供指导。

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