Article Info

蚁参蠲痹胶囊由颈复康药业集团有限公司生产，临床用于治疗类风湿性关节炎（中医辨证为脾肾两虚、寒湿瘀阻证）的常用中成药。处方由蚂蚁、人参、丹参等15 味中药组成，具有祛风除湿、补肾健脾、活血通络的功效[1]。丹参[2]为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根茎，丹参酮类是其主要化学成分，具有良好的活血化瘀、祛瘀通络功效，且研究表明丹参酮类化合物具有良好的抗炎功能[3-6]，在治疗类风湿性关节炎中起重要的作用。蚁参蠲痹胶囊现行注册标准只建立了丹参酮ⅡA的含量测定方法，为了更加全面地控制药品质量，本实验建立高效液相色谱法同时测定制剂中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量，为更加全面地控制蚁参蠲痹胶囊质量提供科学的依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；MS204TS 电子分析天平（万分之一）；XSE205 电子分析天平（十万分之一）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

隐丹参酮（批号：110852-201807，供含量测定用）、丹参酮ⅡA（批号：110766-202022，供含量测定用），均购于中国食品药品检定研究院；丹参酮Ⅰ（批号：568-73-0，上海诗丹德标准技术服务有限公司，供含量测定用）；蚁参蠲痹胶囊（批号：920246B、020074、020261），为市售品；甲醇为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为自制纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent 5 TC-C18 色谱柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.02%磷酸溶液（75∶25）；检测波长为270 nm；体积流量为1.0 mL/min；柱温25℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液精密称取三种丹参酮类对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为16、5、15 μg/mL 的对照品混合溶液。

2.2.2 供试品溶液取本品内容物约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超声处理（功率150 W，频率40 kHz）30 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液按处方中药味比例和制备工艺，制备缺丹参阴性样品，同“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液即得。

2.3 专属性试验

分别取对照品、供试品及阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，色谱图见图1，结果显示，阴性无干扰，该方法专属性良好。

图1 高效液相色谱法色谱图

1：丹参酮Ⅰ；2：隐丹参酮；3：丹参酮ⅡA
A：对照品；B：样品；C：阴性样品

2.4 线性关系考察

精密称取三成分对照品适量，置于同一棕色量瓶中，加甲醇制成每1 毫升含丹参酮ⅡA 200 μg、隐丹参酮200 μg、丹参酮Ⅰ50 μg 的混合对照品储备液。

分别精密量取上述混合对照品储备液4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mL于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得标准溶液。按“2.1”项下色谱条件测定，以待测成分质量浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，结果详见表1。

表1 三种成分线性回归方程和线性范围

2.5 精密度试验

吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱峰面积，结果显示，丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 的RSD分别为0.61%、0.29%、0.19%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

室温下取供试品溶液（批号：920246B），分别于0、2、4、6、8、12、24 h 测定目标成分峰面积，计算丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 的峰面积RSD分别为0.91%、0.43%、0.83%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批样品，按“2.2.2”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，测得丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量对应的RSD分别为2.21%、0.74%、0.81%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称定已知含量的蚁参蠲痹胶囊内容物9 份，每份0.75 g，分别精密加入约相当于样品含量50%、100%、150%的混合对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进液相分析，计算平均回收率及RSD值，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=9）

2.9 样品含量测定

取不同批号的样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定样品含量，结果详见表3。

表3 样品含量测定结果（n=2，mg/g）

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

在参照相关文献[7-15]后，考察不同体系及不同比例的流动相（乙腈-0.02%磷酸、甲醇-水、乙腈-1%醋酸及乙腈-甲醇-水），经比较采用流动相甲醇-0.02%磷酸（75∶25）等度洗脱时，隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA 的分离效果最好。并对各指标成分进行紫外全波长扫描，结果显示，丹参酮Ⅰ、隐丹参酮及丹参酮ⅡA 分别在248、268、270 nm 处有最大吸收，参考相关文献[16-18]并查阅《中华人民共和国药典》2020版一部[2]中丹参药材项下丹参酮类的含量测定，蚁参蠲痹胶囊中三个指标性成分在270 nm 处均有较大吸收，最终确定检测波长为270 nm。由于篇幅所限，该色谱条件优选过程前文并未全部列出。

3.2 方法学耐用性考察

考虑到所建立的方法应具有耐用性，对不同流速、不同柱温以及不同的色谱柱进行耐用性考察，结果显示，在流速为0.8、1.0、1.2 mL/min 下，各指标性成分分离效果均较好，分离度与RSD值均达到要求。在柱温为20、25、30℃下各指标性成分与相邻杂峰的分离度均较好，丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA 含量测定的RSD值为3.97%、0.66%、2.74%，表明柱温对丹参酮Ⅰ的含量测定有一定影响，因此在含量测定过程中要严格控制柱温。依次考察了Agilent 5 TC-C18、Kromasil、Inertsil-ODS、YMC色谱柱，结果显示，四种色谱柱分离效果均较好；另外还发现，使用Agilent 5 TC-C18 与YMC 色谱柱时丹参酮Ⅰ先于隐丹参酮出峰，而换为Kromasil 与Inertsil-ODS 色谱柱后，丹参酮Ⅰ与隐丹参酮的出峰顺序互换，由于篇幅所限，该方法学耐用性考察部分前文并未全部列出。

3.3 小结

本实验采用高效液相色谱法同时测定蚁参蠲痹胶囊中的丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量，经方法学研究，结果表明该方法重复性好，稳定性高，回收率好，专属性较强。本法操作简单、结果可靠，为更好地控制蚁参蠲痹胶囊质量提供参考。

[参考文献]

[1]李俊芳，崔雅慧，郑艳春，等.HPLC测定蚁参蠲痹胶囊中丹酚酸B的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（18）：103-105.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2020：77-78.

[3]戴新新，宿树兰，郭盛，等.丹参酮类成分的生物活性与应用开发研究进展[J].中草药，2017，48（7）：1442-1448.

[4]计思敏.白花、紫花丹参中丹参酮类成分的差异性及其抗类风湿性关节炎的作用研究[D].武汉：湖北中医药大学，2017.

[5]张珊.丹参酮ⅡA 通过调节中性粒细胞活性治疗类风湿关节炎的研究[D].北京：北京中医药大学，2017.

[6]徐西林，张晓峰，吕航，等.丹参注射液对骨性关节炎模型兔膝关节软骨细胞p-IκBα表达影响的实验研究[J].中国中医药科技，2017，24（4）：438-440.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2020：416-417.

[8]吴笛，臧忠良，王德勤，等.一测多评法测定复方丹参片中4种丹参酮类成分的含量[J].中国药学杂志，2012，47（18）：1509-1513.

[9]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2020：1857.

[10]秦增贵，柳克浩，高长青，等.一测多评法测定白花丹参中丹参酮ⅡA、隐丹参酮和丹参酮Ⅰ的含量[J].药学研究，2016，35（8）：457-459，496.

[11]邓俊杰.一测多评法测定紫龙金片中丹参酮类成分的含量[J].药物分析杂志，2015，35（7）：1198-1204.

[12]武爱玲.一测多评法与外标法测定养血止疼丸中3种丹参酮类成分[J].世界中医药，2017，12（11）：2783-2785，2790.

[13]陆瑶，李秀明.一测多评法同时测定心可宁胶囊中5种指标性成分的研究[J].中国药师，2018，21（4）：743-746.

[14]李薇.丹参中丹参酮类成分含量测定[J].亚太传统医药，2017，13（2）：40-41.

[15]张亚中，金斌，黄丽丹，等.HPLC测定128 批丹参舒心胶囊中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的含量及结果分析[J].中成药，2011，33（1）：65-69.

[16]秦学玲，秦兴卫，马娜，等.HPLC 法测定丹参片中4种丹参酮类成分的含量[J].西北药学杂志，2019，34（4）：487-491.

[17]余辉，何劲松.HPLC 法测定心可舒片中的丹参酮成分含量[J].海峡药学，2013，25（9）：56-58.

[18]王艳伟，代雪平，王晓伟.HPLC 法测定益心通脉颗粒中丹参酮Ⅰ、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量[J].西北药学杂志，2018，33（4）：471-474.